随着工业的发展,重金属污染已成为全球关注的问题。目前,我国有数千万亩的重金属污染土壤,极大地危害了人类健康。因此,有效地去除重金属污染成为当前十分迫切的任务。植物修复技术(phytoremediation)的分子生物学研究是当前环保领域的研究热点。传统的植物修复主要依赖于从污染环境中寻找超富积植物,不仅花费时间长,而且所发现的超富积植物通常都具有生物量小,生长缓慢,缺少将污染物通过根部运输到地上部分的能力等问题,极大地限制了植物修复的应用和发展。利用转基因技术筛选和培育具有高生物量的速生重金属富集或超富集植物,是开发和利用植物修复技术进行污染土壤净化的有效新途径。基因工程在植物重金属的富集方面已取得了一些相关的研究进展,已识别和克隆了大量相关基因,并将这些基因转入植物中,用于重金属污染的土壤修复研究。许多实验表明,将动、植物本身与重金属脱毒相关的基因转入高生物量植物,异源表达产物可介导转基因植物耐受和高积累重金属。植物络合素(Phytochelatins, PCs)是由重金属诱导而合成的一类小分子多肽,能鳌合重金属,从而减轻重金属对植物的毒害,是植物应对重金属胁迫的最重要机制。其合成限速酶基因主要有植物络合素合酶基因(PCS)及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(γ-ECS),已在生物量小的拟南芥和印度芥菜中证实了它们富集重金属的功能。芦苇(Phragmites australi(Cav.) Trin. ex Steud)具有很强的净化污染的能力,可超富集重金属(Cd2+、Pb2+、Zn2+),为湿地处理污水的主要物种,其重金属富集关键酶基因的克隆研究尚未见报道。剪股颖(Agrostis palustris Huds)和高羊茅(Festuca arundinacea Tall Fescue)为世界范围内广泛种植、生物量大、生长快的优良草坪草。尚未见对它们进行重金属富集相关基因转化的报道。利用基因工程获得的高富集/抗重金属草坪草经不断切割、回收,可减少土壤重金属的富集量,从而实现修复重金属污染土壤的目的。因此,开展转基因草坪草富集重金属的研究具有重要意义。本实验室在前期实验中从芦苇中克隆了与γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(PaGCS),并将该基因转入了生物量高、生长快的草坪草翦股颖中,获得了5株转PaGCS的剪股颖植株。在此基础上,本文首次克隆了芦苇中植物络合素合酶基因的全长cDNA (PaPCS);完成了PaPCS在Zn、Cd敏感型酵母YK44中的功能验证；实现了单基因(PaPCS, PaGCS)和串连双基因(PaPCS/PaGCS)对草坪草高羊茅胚性愈伤组织的转化,分析了转基因植株的生物学效应(富集/抗重金属),探讨了高羊茅富集重金属与基因协同效应的关系,筛选出了高富集/抗重金属镉的转基因高羊茅。同时,对获得的转PaGCS剪股颖进行了分子生物学鉴定、生长特性、生理生化分析、富集/耐受镉能力检测,筛选高富集/抗重金属的剪谷颖新品系,为进一步研究转基因草坪草富集/抗重金属镉的分子机制以及大规模修复重金属污染土壤奠定了基础。另一方面,亦开展了NAC膜结合转录因子NTL5介导的拟南芥晚花的分子机制研究。主要研究过程及实验结果包括：1植物络合素合成关键酶—植物络合素合酶基因的克隆及功能鉴定1.1 PaPCS基因cDNA全长序列的克隆采用RACE-PCR技术,从芦苇中分离了1个植物络合素合酶基因的全长cDNA,命名为：PaPCS。序列分析表明,其ORF核苷酸长度为1497bp,编码498个氨基酸,蛋白质分子量为54.9kDa。1.2 PaPCS基因的序列分析系统树分析表明,该基因核苷酸序列在进化上与小麦、狗牙根和水稻具有较高的相似性,分别为84.3%、84.29%和70.94%。蛋白质聚类分析发现,该基因编码蛋白与狗牙根的PCS同源性最高。1.3 PaPCS在Zn、Cd敏感型酵母的功能确定构建了酵母表达载体pYES2-PaPCS,转入Zn、Cd敏感型酵母菌株YK44中。酵母互补实验结果表明,在100μM CdCl2胁迫下,转PaPCS的酵母生长状况明显好于对照(非转基因酵母),说明PaPCS的过量表达提高了缺陷型酵母细胞对Cd的抗性。1.4 PaPCS和PaGCS在高羊茅中的功能确定1.4.1植物过表达载体的构建构建了单基因(PaPCS和PaGCS)及串联双基因(PaPCS/PaGCS)的过表达载体pROK/PaPCS和p3301/PG)1.4.2高羊茅愈伤组织诱导和转化以下胚轴作外植体诱导高羊茅愈伤组织,经继代培养,筛选出黄色、颗粒状胚性愈伤组织(分化频率高,达90%以上)。利用农杆菌介导法,将上述载体分别转入培养7d的高羊茅胚性愈伤组织,暗培养3天,在高浓度(50 mg/L) Kan下筛选出抗性愈伤组织。抗性愈伤组织经IB分化培养基上分化成苗后,用25 mg/L Kan进一步筛选再生植株,获得了197株抗性植株(95株转PaPCS植株、87株转PaGCS植株、15株转PaPCS/PaGCS植株)。1.4.3转基因植株的获得上述抗性植株总DNA用目的基因的特异引物进行PCR检测,鉴定出7株转PaPCS植株、11株转PaGCS植株,3株转PaPCS/PaGCS植株。半定量RT-PCR分析表明,上述转基因植株中目的基因(PaPCS或PaGCS、双基因PaPCS,PaGCS)表达均高于对照。Southern杂交显示,PaPCS以单拷贝的形式整合到了2株转PaPCS植株中；PaGCS以单、双拷贝的形式分别整合在2株转PaGCS植株中；PaPCS和PaGCS均以单拷贝的形式整合在2株转PaPCS/PaGCS植株中。1.4.4 PaPCS和PaGCS在转基因植株中表达产物的SDS-PAGE分析对转基因植株及野生型高羊茅叶片总蛋白的SDS-PAGE分析表明：在转PaPCS植株TPl和TP2和转PaGCS植株TG1和TG2总蛋白中均出现了一条分别与预测的PaPCS和PaGCS蛋白大小一致的新带；转PaPCS/PaGCS植株T(GP)-1和T(GP)-2总蛋白中则两种新带都存在,表明,异源目的基因(PaPCS和PaGCS)能够在转基因植株中表达出相应的目的蛋白。1.4.5镉胁迫下转基因高羊茅的生长情况及Cd富集量0.15mM CdCl2处理5天后,转基因株系的生物量均高于野生型高羊茅,其中转PaPCS/PaGCS植株的生长量最高,转PaGCS植株次之。同时利用ICP-MS技术对其根、叶以及全植株的镉含量进行测定发现镉处理5天后,无论是转基因植株,还是野生型植株,其根中的镉含量都高于叶中。比较三种转基因植株及野生型发现根、叶以及全植株的镉含量：转PaGCS/PaPCS植株＞转PaGCS植株＞转PaPCS植株＞WT(野生型)。并且转基因植株叶/根镉含量比值都在不同程度上比野生型有了增加,其中T(GP)-2叶和根中的镉含量几乎相当,表明转基因导致了植株体内富集的镉向叶中的转移。1.4.6镉处理下转基因高羊茅GSH、PC、TNP-SH含量对转PaPCS、PaGCS及PaPCS/PaGCS植株和野生型对照在0.15 mM CdCl2分别处理0h,6h,12h,24h,48h,72h,120h后的GSH、TNP-SH和PC含量分析发现,镉处理0h时,三种转基因植株GSH含量与野生型对照相近,而PC和TNP-SH含量均高于野生型植株。随着Cd处理时间的延长,各种转基因植株和野生型中GSH含量变化不明显,PC和TNP-SH含量均持续增加。到处理5 d时,PC和TNP-SH含量均达到最高,总体变化趋势是：转PaPCS/PaGCS植株>转PaGCS植株>转PaPCS植株>WT(野生型),表明转双基因(PaPCS/PaGCS)植株比转单基因(PaGCS或PaPCS)植株可能累积了更多的植物络合素。1.4.7镉处理下转基因高羊茅MDA含量、POD和SOD活性对转PaPCS, PaGCS及PaPCS/PaGCS植株和野生型对照在0.15 mM CdCl2分别处理0h,6h,12h,24h,48h,72h,120h的MDA含量和SOD和POD活性分析发现,镉处理6h后,转基因植株和野生型对照叶片MDA含量开始明显上升,野生型上升速度最快。具有最高生物量的T(GP)-1和T(GP)-2 MDA的增长趋势最缓慢,TG-1和TG-2次之；TP-1和TP-2的增长速度最快,野生型最高,表明,转基因植株膜脂过氧化程度较轻,其中PaPCS的异源表达对转基因植株细胞起到了一定程度的保护作用,但是效果不如PaGCS明显。三种类型的转基因植株和野生型SOD和POD活性均在镉胁迫初期有一个活性高峰,SOD活性的峰值出现在镉处理6小时后,此时SOD活性转PaGCS/PaPCS植株＞转PaGCS植株＞PaPCS植株＞WT(野生型)；而POD活性的峰值则出现在镉处理12小时后,此时POD活性也是转PaGCS/PaPCS植株>转PaGCS植株>PaPCS植株＞WT(野生型)。之后SOD和POD活性急速降低。因此,镉处理24h后SOD和POD活性均低于了初始值。所有转基因植株SOD和POD活性均低于野生型植株,两者的活性均为PaPCS/PaGCS植株＞转PaGCS植株＞PaPCS植株>WT(野生型)。本文亦对转PaGCS剪股颖进行了分子生物学鉴定、生长特性、生理生化分析、富集/耐受镉能力检测的研究。2芦苇γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的异源表达对剪股颖镉累积的影响2.1转基因翦股颖的检测将5株转PaGCS剪股颖(T1-T5)进行目的基因PaGCS的PCR检测,发现5株转基因剪股颖中均含有目的片段。应用Southern blot技术,进一步对上述转基因植株中PaGCS是否存在及其拷贝数进行分析。发现PaGCS基因在T1、T2、T4和T5基因组中以单拷贝的形式存在,在T3基因组存在2个拷贝。2.2基因表达分析利用半定量RT-PCR分析转基因翦股颖和野生型GCS的表达情况,结果表明,转基因翦股颖的GCS表达高于野生型,其中,T4和T5的表达量最高。在CdCl2处理和对照(非处理)条件下,转基因翦股颖和野生型根和叶中植物络合素合成基因GCS, GS和PCS表达水平变化分析发现,对照条件和处理条件下,与野生型相比,转基因株系根和叶的GCS和PCS表达水平高,而GS和GST表达变化不明显,说明,GCS和PCS表达受CdCl2诱导。进一步利用qRT-PCR分析发现,转基因株系中PaGCS表达明显高于野生型。2.3 PaGCS在转基因翦股颖中表达产物的SDS-PAGE分析对转基因翦股颖T2、T5及野生型对照的叶片总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析表明,T2和T5总蛋白中出现了一条分子量与推测的PaGCS蛋白的大小一致的新带,表明,PaGCS能在转基因翦股颖中表达目的蛋白。2.4镉胁迫下转基因翦股颖的生长情况转基因剪股颖和野生型在0.15 mM Cd Cl2处理5天时均出现一定程度的叶片枯黄的现象,但与野生型相比,叶枯黄程度明显减轻。对转基因剪股颖与野生型在0.15 mM Cd Cl2分别处理5d及21d的生物量测定发现,处理5d时,转基因株系T1、T2、T3和T4的生物量与野生型差别不明显,T5明显高于野生型。处理21d时,T2、T4和T5生物量都明显高于野生型,其中T5仍然最高,而T1和T3则明显低于野生型。2.5镉富集能力分析在0.15 mM CdCl2分别处理5d及21的转基因剪股颖和野生型根、茎和叶镉含量测定表明,大多数转基因剪股颖株系的根、茎、叶中富集的镉高于野生型对照。转基因植株T1-T5的根均能吸收重金属镉,T4和T5根能够吸收镉,并将其转运到地上部分。2.6 GSH, PC和TNP-SH含量分析对转PaGCS翦股颖和野生型对照在0.15 mM CdCl2分别处理Oh,6h,12h, 24h,48h,72h,120h后的GSH、TNP-SH和PC含量分析发现,CdCl2处理前、后,各转基因株系的GSH的含量与野生型相比没有明显的差别。转基因株系的PC和TNP-SH含量在CdCl2处理前与野生型相近,而在处理后比野生型对照明显增高。2.7 MDA含量、POD和SOD活性分析对转PaGCS翦股颖植株和野生型对照在0.15mM CdCl2分别处理0h,6h,12h, 24h,48h,72h,120h的MDA含量和SOD和POD活性分析发现,镉处理下,野生型叶片中MDA含量上升速度快于转基因株系。所有转基因植株SOD和POD活性的峰值均低于野生型对照,达到峰值后,二者的活性下降速度均快于野生型,表明转基因植株受到的Cd毒害较轻。3 NAC膜结合转录因子NTL5的功能鉴定3.1 NTL5的序列分析NTL5的N端含有NAC结构域,使用跨膜结构分析软件conpredⅡ,分析NTL5的序列发现,在5’端含有一个21个碱基的跨膜基序,推测NTL5是NAC膜结合转录因子家族的一员。3.2 NTL5的时空表达模式qRT-PCR分析发现,NTL5在前4周表达量逐渐增加,随后略有下降,到第4周时表达量最高,表明NTL5可能在拟南芥开花发育过程中发挥作用。NTL5在各个组织器官中都有表达,在芽尖的表达量最高,表明NTL5可能与茎尖分生组织的发育有关。对NTL5的亚细胞定位分析发现,全长NTL5定位于洋葱表皮细胞和拟南芥原生质体细胞核和细胞膜上,而去除跨膜基序的NTL5定位在细胞核中。3.3 NTL5对激素和非生物胁迫的应答模式对NTL5对盐、干旱和冷胁迫的应答模式分析发现,NTL5受盐和干旱胁迫诱导、而不受冷胁迫诱导。NTL5对各种激素(ABA、BA、BL、IAA、NPA和SA)的应答模式分析发现,NTL5受ABA和SA诱导。3.4 NTL5 RNAi系为了研究NTL5的功能,构建了RNAi载体,转化拟南芥,获得了20株T2代NTL5 RNAi纯系植株(mNTL5)。经过RT-PCR验证表明,mNTL5中NTL5基因的表达确实被抑制。3.5 NTL5过表达系克隆NTL5全长、去除跨膜基序的NTL5(5ΔTM)、去除C端的NTL5(5ΔC)、5△C的N端片段(5ΔC-C)、5ΔC的C端片段(5△C-N)序列,构建它们的过表达载体,转化拟南芥,获得T0代阳性植株。过表达5ΔTM、5ΔC颜色浓绿,生长缓慢,植株矮小,无法开花结实。其余均获得T2代纯系。在210个35S::NTL5中,大多数株系表型与野生型Col-0没有区别,但36个株系表型较为一致,出现了不同程度的晚花、分枝减少、颜色加深、植株矮小与生长缓慢,而35S::5⊿C-C和35S::5⊿C-N表型均与野生型相似。选择表型明显的纯系进行后续研究。3.6三系表型分析在长日照(16h光照、22℃/8h黑暗、20℃)条件下,35S::NTL5开花时间比野生型Col-0晚18天左右,成熟的植株矮小,生长缓慢,叶片浓绿、分枝数目极少(仅1-2个)；mNTL5开花时间比Col-0早6天左右,生长正常、分枝数目多、多数在茎生叶叶腋处多生一个附着枝。200mM NaC1处理条件下,35S::NTL5的开花时间受到显著延迟,开花时间比Col-0晚36天左右,而mNTL5受盐处理影响较小,比Col-0早6天左右。3.7 NTL5可能不参与四条主要开花途径三系在短日照条件下、GA处理、春化处理下开花时间的变化分析表明,三系都能正确应答光周期变化、GA处理、春化处理。三系中上述途径的主要调控基因表达水平的RT-PCR分析发现,相关基因的表达水平在三系中没有变化,说明NTL5可能不参与四条主要开花调控途径。3.8 NTL5抑制LFY和AP1的表达三系中其他开花整合子基因的表达变化分析发现,LFY和AP1在35S::NTL5表达明显下调,在mNTL5表达略有上调。推测NTL5可能通过抑制LFY的表达而引起拟南芥晚开花。3.9 NTL5结合LFY启动子区域序列分析发现,LFY和AP1启动子区域有NAC转录因子结合靶基因的核心序列,EMSA实验证实,NTL5蛋白可以与LFY的启动子区的核心序列结合,但是不能与AP1的启动子区的核心序列结合,表明LFY是NTL5直接作用的靶基因。3.10杂交实验将35S::LFY与35S::NTL5杂交,发现杂交系晚花表型消失,说明,LFY的过表达截断了NTL5抑制开花的分子途径。从而证实了NTL5是通过调控下调LFY表达来引起拟南芥晚开花。总之,拟南芥NAC膜结合转录因子NTL5通过直接抑制LFY的表达的方式延迟开花时间。