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低温是影响植物生长、发育的重要因子之一,在抗寒锻炼中,植物体内会发生多种生理生化反应,其中包括膜质脂肪酸不饱和性降低,低温诱导基因表达等。脂肪酸的不饱和性对植物抗寒性有重要影响,在多种植物的研究表明编码脂肪酸脱饱和酶的基因是提高植物抗寒性育种的选择之一。低温诱导基因的表达具有稳定细胞质和细胞膜的作用,DREB转录因子可以启动整套低温诱导基因的表达,具有抗寒锻炼的作用,同时可以提高植物抗旱和耐盐特性。本文研究包括△9脂酰脱饱和酶基因desC在百脉根中的表达和DREB基因部分序列的克隆。研究结果如下:
构建了2个desC基因植物表达载体,pBI121-desC和pCAMBI1301-desC。转化试验表明前者的转化效率较高于后者,但后者在工程菌株中的拷贝数较高,便于基因操作,也可作为desC基因植物表达载体。
在农杆菌培养至OD<,600>为0.6,侵染百脉根子叶20min,共培养3d的转化效率最高,为21.7%。卡那霉素对百脉根抗性愈伤筛选的适宜浓度为50mg/L。在侵染菌液中加入乙酰丁香酮会降低百脉根的转化效率,在共培养基中加入乙酰丁香酮可提高百脉根的转化率,浓度为10mg/L时百脉根的转化效率可达23.3%。
desC基因的转入提高了百脉根的抗寒性。转基因植物叶片中16:1单不饱和脂肪酸含量明显高于对照植株,而16:0、18:0的含量低于对照植株;O℃低温处理下,转基因植株未出现低温伤害症状,伤害率较低,处理后的光合速率较高,并在正常生长条件下可恢复到处理前的水平。而对照植株在0℃低温处理下出现萎蔫症状,伤害率较高,光合速率发生不可逆的伤害。
从百脉根基因组DNA中扩增出DREB类转录因子基因的504bp的片段LcDP,它编码的氨基酸片段与拟南芥DREB2B的相似性达到49.7%,与大豆和鹰嘴豆的DREB基因的相对位置的相似性分别为83.2%和72.62%。该片段与大豆的GmDREB、GmDREBa以及鹰嘴豆的CaDREB相比,离起始密码子只差1个氨基酸的序列,下游缺少37个氨基酸的序列,包含了整个DREB/AP2结合域,第14位到第19位的氨基酸序列为V AE I R E,一个推测的富含赖氨酸的核定位信号区,以及下游酸性激活域的44个氨基酸序列。