α-淀粉酶（EC 3.2.1）是一类能够降解淀粉的酶,其中一部分既具有水解酶的活性又具有转苷酶的活性,被称为多功能淀粉酶。本实验室克隆并表达了多功能淀粉酶OPMA-G,在结构上它具有α-淀粉家族共有的4个保守的区域,同时功能上又兼有水解酶和糖苷转移酶的催化活性,其催化淀粉降解的产物为麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖,但不产生葡萄糖,其中异麦芽三糖和异麦芽四糖属于异麦芽低聚糖。异麦芽低聚糖具有双歧因子功效,相对于传统糖而言,他们具有改善肠道微生物菌群的功能,并能够预防龋齿。因此,对OPMA-G结构与功能的研究可为此类酶的分子改造和功能优化提供理论指导。 为了阐明OPMA-G的特异C端结构域的功能,本论文基于本室保留的OPMA-G基因获得了C端截短的ΔOPMA-G的基因,构建了重组表达载体pET28a-ΔOPMA-G,并在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了有效表达,表达产物以包涵体形式存在,表达率为42%。对表达的包涵体采用脲素浓度梯度透析的方法进行完全复性,复性的ΔOPMA-G经SDS-PAGE检测纯度达85%以上。通过对比分析OPMA-G与ΔOPMA-G的性质与功能,结果显示：OPMA-G与ΔOPMA-G的比活力分别为8.22 U/mg,6.53 U/mg,最适温度分别为50℃,40℃,最适pH均为7.5。OPMA-G与ΔOPMA-G均只特异性识别和水解淀粉,但不作用普鲁兰和p-环糊精,酶促生成产物也均为麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖及异麦芽四糖,产物比例无差异。此外,OPMA-G与ΔOPMA-G均表现为非钙离子依赖性酶,Zn2+Ni2+和K+对两者均有激活作用,而Fe3+,Fe2+,Cu2+及EDTA均有抑制作用。非变性电泳结果显示：ΔOPMA-G仍以单聚体、二聚体、三聚体等多聚体的状态存在,说明C端对OPMA-G寡聚化无影响。相对于OPMA-G的淀粉吸附率（8.5%）,ΔOPMA-G降低为5.8%,由此推测OPMA-G的C端与底物的吸附相关,C端的缺失引起了底物吸附率的降低,进而影响了酶活力的降低。 为了进一步研究OPMA-G的结构与功能的关系,本论文对多功能淀粉酶OPMA-G进行同源建模及序列分析,选定V200进行定点突变来研究V200位点对于酶的影响。实验采用重叠PCR方法得到OPMA-G的两个点突变体OPMA-GM3 （V200G）和OPMA-GM4 （V200K）基因,并构建了重组表达载体pET28a-OPMA-GM3和pET28a-OPMA-GM4。两个突变体分别在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了有效表达,表达率分别为37%和38%。表达产物OPMA-GM3、OPMA-GM4均为可溶性表达,经Ni2+-NTA柱纯化后,SDS-PAGE检测纯度均在95%以上。与野生型OPMA-G的比活力8.22 U/mg相比,突变体OPMA-GM3、OPMA-GM4的比活力分别为9.51,8.63U/mg。酶学性质研究结果表明：突变体OPMA-GM3、OPMA-GM4同样只特异性的识别和水解淀粉底物,OPMA-GM4同OPMA-G一样水解淀粉产物为麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖及异麦芽四糖,OPMA-GM3产物除上述低聚糖外还有葡萄糖,而且麦芽糖明显增多,而OPMA-GM4的催化产物中异麦芽三糖的比例增多。两种突变体酶的最适温度仍为50℃,在30℃-70℃孵育1h后仍能保持70%以上的活力。OPMA-GM4的最适pH未发生变化,仍为7.5,pH稳定性也无变化,但OPMA-GM3的最适pH则降低为7.0,其pH稳定性也发生了酸移。此外,各种离子对突变体酶的影响与野生酶OPMA-G相同。以上实验结果表明：位点V200的空间位阻与电荷对酶的催化性质可能均有影响,较大的空间位阻和正电荷有利于分支产物的生成。 迄今为止,人们对多功能淀粉酶的结构与功能的关系仍未了解透彻,其水解、转苷的催化机制也未完全阐明。近几十年来,研究者不断的通过分子改造技术来研究多功能淀粉酶的结构与功能的关系。由于计算机模拟技术的提高,定点突变技术更多的应用于多功能淀粉酶的分子改造。本课题着重分析了多功能淀粉酶OPMA-G的C端片段及V200位点对酶催化功能的影响,为进一步优化OPAM-G的功能提供了理论依据,为其工业应用奠定了基础。