论文部分内容阅读
桑黄和牛樟芝作为极珍贵的药用真菌,其杰出的生理功效备受世人关注。目前主要是针对桑黄和牛樟芝的子实体进行了较多的研究,但是这些真菌在野外生长缓慢,数量稀少,不利于大规模的研究和应用。本文利用实验室固态发酵或液态发酵培养的桑黄和牛樟芝菌丝体,提取其中的多糖和三萜类物质,对其体外抗肿瘤活性、药物作用时间、安全性、抗细胞迁移等活性进行研究,并分析各活性组分对肿瘤细胞内TOP1/TDP1介导的DNA损伤通路的抑制作用。主要结果如下:由桑黄和牛樟芝菌丝体中分离纯化获得以下四种活性物质:由固态发酵桑黄菌丝体提取获得粗多糖组分PS;由液态发酵牛樟芝菌丝提取纯化得到均一纯化多糖组分ACPS-1;由固态发酵牛樟芝菌丝体提取获得的三萜类混合物ACT-I和ACT-N。抗肿瘤活性实验表明,PS能抑制Hep G2、HeLa、Lovo、S180、H22细胞的体外增殖,最大抑制率为65.00%,92.38%,36.30%,61.83%,94.83%。ACPS-1能抑制A431、HeLa、S180、H22细胞的体外增殖,最大抑制率为36.89%,74.09%,70.61%,69.07%。ACT-I能抑制HeLa、S180细胞的体外增殖,最大抑制率为73.54%,78.81%。ACT-N能抑制HeLa、S180细胞的体外增殖,最大抑制率为59.87%,71.49%。对这四种活性组分进行安全性分析,发现PS、ACT-I、ACT-N对RAW264.7细胞没有抑制效果,而ACPS-1在浓度超过100μg/mL时,对RAW264.7细胞有显著的抑制作用,抑制率低于30%。同时,发现PS、ACPS-1、ACT-I和ACT-N对脾脏混合细胞没有抑制效果,且能够促进脾脏细胞的体外增殖,尤其是ACT-I和ACT-N,增殖率超过120%。该实验证明PS、ACPS-1、ACT-I和ACT-N四个活性组分安全性高,对正常细胞不存在较为明显的抑制增殖的作用。使用HeLa细胞进行Annexin V-FITC/PI细胞周期以及细胞凋亡效果实验。在PS的作用下,HeLa细胞发生早期凋亡细胞比例较高,DNA复制过程停留在G2/M期;ACPS-1主要诱导HeLa细胞发生晚期凋亡,使细胞DNA复制过程停留在G2/M期;ACT-I和ACT-N诱导S180细胞凋亡,使发生早期凋亡的细胞比例升高,DNA复制过程停留在G2/M期的细胞比例升高,同时停留在G0/G1期细胞比例也显著提高。对由拓扑异构酶I和酪胺酰-DNA-磷酸二酯酶I介导的DNA损伤修复通路上的两个关键蛋白:拓扑异构酶I和酪胺酰-DNA-磷酸二酯酶I进行检测。使用ELISA法检测在各活性组分作用下这两种蛋白的含量,发现在PS、ACPS-1、ACT-I和ACT-N的作用下,拓扑异构酶I和酪胺酰-DNA-磷酸二酯酶I的含量显著降低,并在一定浓度范围内呈现出剂量依赖性。使用实时荧光定量PCR法对拓扑异构酶I和酪胺酰-DNA-磷酸二酯酶I的表达量进行检测,发现这两种蛋白的表达量显著的下降。使用HeLa细胞进行划痕实验,发现PS、ACPS-1、ACT-I和ACT-N都能够抑制HeLa细胞的迁移,从而发现这些活性组分能够通过抑制肿瘤细胞迁移的方式抑制肿瘤细胞增殖。综上所述,本课题研究证明PS、ACPS-1、ACT-I和ACT-N在抗肿瘤方面有着较好的效果,对它们的发挥抑癌作用的机理也在不断深入探索中。这些活性在开发新型保健食品或药品方面,具有诱人的前景。