研究背景与目的食管癌（Esophageal cancer,EC）是一种严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤,在我国恶性肿瘤死因中排名第四位。研究表明,食管癌作为一种环境相关性肿瘤,是由环境因素和遗传因素相互作用所致的复杂性疾病。亚硝胺类化合物是一种强致癌物,流行病学研究发现,当水源水被含氮化合物污染后,再经氯化消毒产生的亚硝胺类消毒副产物可能是致食管癌的重要污染物。近年来,由于我国水环境的广泛污染,其中水体富营养化越来越严重,这致使各大湖泊均发现有大量藻类繁殖。微囊藻毒素是微囊藻细胞破裂产生的次级代谢产物,在水体富营养化较严重的水源水中,藻毒素可直接进入集中式供水的管网末梢水,人群可经饮水长期持续暴露于藻毒素。藻毒素具有强烈的毒性,有研究已证实藻毒素在体内外均有潜在的促癌作用。本课题组前期研究已发现并证实亚硝胺和藻毒素联合染毒可诱导EC的发生发展,但对于长链非编码RNA（lncRNA）是否参与该过程,以及lncRNA是否对EC具有调控作用及其相关分子机制,目前研究尚不清楚。本文研究目的是通过通过高通量芯片技术比较EC相关lncRNAs表达谱;通过差异倍数、lncRNAs子类分析、邻近编码基因信息分析、lncRNA-mRNA共表达分析等策略筛选EC相关lncRNA分子;对lncRNA-UCA1在EC组织和细胞的表达进行验证;探讨lncRNA-UCA1在EC组织中表达水平与EC发病风险及临床病理参数相关性;进一步探讨lncRNA-UCA1对EC109细胞表型的影响及其机制,从而为阐明lncRNA-UCA1在EC中的分子调控机制,发展其可用于EC高危人群筛检和早期诊断的新型表遗传标志,并为EC的治疗提供有效的潜在作用靶点。研究方法1.应用lncRNA和mRNA高通量芯片技术筛选食管癌组织和癌旁组织中的差异lncRNA和mRNA表达谱,结合lncRNA子类分析,mRNA的GO、KEGG分子,以及生物信息学分析构建lncRNA-mRNA共表达网络,进一步筛选出食管癌相关lncRNA。采用qRT-PCR技术在扩大食管癌人群样本中对筛选出的lncRNA进行验证,条件logistic回归分析其异常表达与食管癌发病风险之间的关系,采用两独立样本t检验分析候选lncRNA表达水平与食管癌临床病理参数之间关系2.构建lncRNA-UCA1慢病毒过表达和干扰载体系统,分别将其转染至食管鳞癌EC109细胞中建立lncRNA-UCA1过表达和干扰稳转细胞模型,应用qRT-PCR技术检测稳转后lncRNA-UCA1表达情况,以评价慢病毒过表达和干扰效率。进一步在此基础上分析过表达和干扰lncRNA-UCA1对食管鳞癌EC109细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能影响,包括CCK8法检测细胞增殖、Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力。采用裸鼠皮下成瘤实验和尾静脉转移瘤实验检测过表达lncRNA-UCA1对裸鼠体内肿瘤形成和远处转移能力的影响。3.构建lncRNA-UCA1真核表达载体,并在食管鳞癌EC109细胞中过表达,应用qRT PCR、荧光素酶报告基因（DLR）、蛋白免疫印迹（Westernblot）、RNA-pulldown、蛋白银染实验、质谱鉴定、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNABinding ProteinImmunoprecipitation,RIP）等技术,寻找并验证与lncRNA-UCA1直接结合靶蛋白及其相关信号通路4.通过对肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）大数据库中筛选食管癌组织和癌旁组织中差异miRNA和mRNA表达谱,应用生物信息学预测软件（TargetScan和miRanda）,再结合ceRNA理论构建lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络,经DLR系统进行初步筛选,确定lncRNA-UCAl/miR-18a-5p/SORBS2信号轴作为后续研究目标,分别应用DLR qRT-PCR、MS2-RIP、Western blot等技术验证该信号轴对食管鳞癌EC109细胞的增殖影响及分子调控作用机制5.构建亚硝胺（NMBA）和藻毒素（MCLR）体外染毒诱导正常食管上皮Het-1A细胞发生恶性转化模型;在该恶转细胞模型基础上,应用qRT-PCR检测lncRNA-UCA1在恶转细胞（慢性染毒处理10代和20代）表达情况,以及在NMBA和MCLR急性处理EC109细胞12h,24h 48h,72h后lncRNA-UCA1表达变化情况;Western blot检测lncRNA-UCA1下游靶分子蛋白FGFR2 Ⅲb和Ⅲc、SORBS2、PI3K-AKT信号通路关键蛋白（PI3K、AKT、P-AKT、PTEN）和EMT标志蛋白（ZO-1、N-Cadherin、E-Cadherin、Snail）表达情况主要研究结果1.食管癌相关lncRNA的筛选及lncRNA-UCA1与食管癌发病风险关系研究1.1食管癌相关lncRNA差异表达谱及其邻近基因的功能分析LncRNA表达谱芯片筛选出1360条在食管癌中具有统计学差异的lncRNAs,其中上调473条,下调887条;根据差异倍数（Fold Change,FC）大于2倍的标准,进一步筛选出差异lncRNAs 745条,其中上调300条,下调445条;对邻近mRNA表达谱分析筛选出1992条差异表达转录本,其中上调1026条,下调896条;根据FC>2进一步筛选出差异转录本1480条,其中上调801条,下调679条;通过对本芯片结果中差异基因进行lncRNA子类分析,mRNA的GO和KEGG Pathway分析,结果显示这些差异基因主要与MAPK信号通路,P53信号通路,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路以及细胞外基质受体相互作用等通路相关。根据差异表达的lncRNAs和mRNAs,进行lncRNA-mRNA共表达分析,在共表达网络总体结构基础上,找到居于该网络中的一个核心基因即UCA1（NR₀15379）,该基因在芯片结果中表达显著下调（P<0.05）,这提示UCA1与食管癌关系密切,可能在食管癌中发挥重要的生物学功能。1.2LncRNA-UCA1与食管癌发病风险的流行病学研究应用 qRT-PCR技术检测人EC细胞（EC109、EC9706、CaEs-17、KYSE150和TE-1）和人正常食管上皮细胞（Het-lA）中lncRNA-UCA1表达特征,结果显示其在5株EC细胞系中表达均显著低于Het-1A（P<0.05）;qRT-PCR结果显示lncRNA-UCA1在115例食管鳞癌组织中表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）;logistic回归分析结果表明,lncRNA-UCA1在食管癌组织中的表达与食管发病风险呈负相关,即低表达的lncRNA-UCA1可显著增加食管癌的发病风险（P<0.05）;单样本t检验对来自TCGA大数据库中81例食管癌组织中lncRNA-UCA1的测序表达值与EC病人的临床病理参数（Age,Gender,Race,Stage,T/N/M,Grade）进行分析,结果显示,lncRNA-UCA1在淋巴结有转移的患者癌组织中表达水平显著低于无淋巴结转移的病人（P<0.05）。这些结果表明lncRNA-UCA1在食管癌组织和细胞中均表达显著低于相应对照组,且其低水平表达可促进淋巴结转移,增加EC患病风险。2.长链非编码RNAUCA1对食管鳞癌细胞的功能学研究2.1 LncRNA-UCA1在食管鳞癌EC109细胞的亚定位情况利用荧光原位杂交实验（FISH）对lncRNA-UCA1在食管鳞癌EC109细胞的分布进行检测,结果发现lncRNA-UCA1的转录本在食管鳞癌EC109细胞的胞浆和胞核内均有分布,但其在胞浆中荧光信号值显著高于胞核（P<0.05）。这提示lncRNA-UCA1在胞浆和胞核的不同分布,可能与其参与不同的信号传导通路有关。2.2 LncRNA-UCAl对食管鳞癌EC109细胞生物学行为的影响将过表达和干扰UCA1慢病毒转染至EC109细胞获得稳定细胞系后,qRT-PCR结果显示,过表达实验组（Lv-UCA1）的lncRNA-UCA1的表达水平比阴性对照组（Lv-NC）高出274.9倍;干扰实验组（UCA1-shRNA#2）lncRNA-UCA1的表达水平被敲低至对照组（Ctrl-shRNA）的32%;当lncRNA-UCA1过表达后,CCK8实验、Transwell侵袭和迁移实验结果显示,与Lv-NC组比较,Lv-UCA1组的细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显著下降（P<0.05）;当lncRNA-UCA1被干扰后,结果发现UCA1-shRNA#2组的细胞增殖能力、侵袭和迁移能力显著提高（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1可能在EC中发挥抑癌功能。2.3 LncRNA-UCA1对裸鼠移植瘤和体内转移的影响通过裸鼠成瘤实验和尾静脉转移瘤实验分别观察lncRNA-UCA1在体内对肿瘤的生长和转移影响。裸鼠成瘤实验结果显示,Lv-UCA1组的肿瘤体积明显低于Lv-NC组（271.29±83.26mm3 vs 676.39±56.80mm3）差异有统计学意义（P<0.05）;Lv-UCA1组的肿瘤重量明显低于Lv-NC组（152.37±78.32mg vs 384.64±68.08mg）,差异有统计学意义（P<0.05）;裸鼠尾静脉转移实验结果显示,Lv-UCA1组肝脏未见明显的转移灶,Lv-NC组可见较为明显的转移灶。这些实验结果进一步证实了 lncRNA-UCA1在体内能抑制肿瘤细胞的生长和远端转移能力。3.LncRNA-UCAl通过结合hnRNPF参与调控FGFR2可变剪接影响食管鳞癌EMT进程3.1 LncRNA-UCA1可在核内特异性结合hnRNP FRNA-Pulldown联合NanoLC-ESI-MS/MS分析结果鉴定出3个可与lncRNA-UCA1结合的蛋白,即hnRNP F（UniProtKB-P52597）、ACTA2（UniProtKB-P62736）、PRSS3（UniProtKB-P35030）,其相对富集度分别为51.6%、19.9%、28.5%,可信度为99%、89.7%,91.1%。基于此结果选取富集度和可信度均最高的蛋白即hnRNPF;RIP和Western blot实验进一步验证了lncRNA-UCA1可特异结合hnRNP F。Western blot发现hnRNP F主要在细胞核中表达,胞浆中基本无表达。qRT-pCR和Western blot结果表明hnRNPF的表达在食管鳞癌EC109,EC9706细胞株及正常食管上皮Het-lA细胞株中表达无显著差异变化（P>0.05）;qRT-pCR和Western blot结果发现过表达或干扰lncRNA-UCA1,均不影响hnRNP F的mRNA和蛋白表达（P>0.05）。以上结果表明,lncRNA-UCA1可在核内特异性结合hnRNPF,且hnRNPF的表达不受lncRNA-UCA1影响。这提示lncRNA-UCA1可能通过结合hnRNPF参与其在核内的信号转录通路。3.2 LncRNA-UCA1通过结合hnRNP F调控FGFR2可变剪接体MiasDB数据库检索结果发现hnRNP F可参与调控FGFR2可变剪接体Ⅲb和Ⅲc的产生;qRT-PCR和Western blot结果显示,过表达lncRNA-UCA1可促进Ⅲb的表达,上调Ⅲb/Ⅲc的比值（P<0.01）;干扰lncRNA-UCA1可促进Ⅲc的表达,抑制Ⅲb的表达,下调Ⅲb/Ⅲc的比值（P<0.01）;FGFR2的总mRNA表达水平不受lncRNA-UCA1过表达或干扰的影响（P>0.05）;应用siRNA技术敲低hnRNP F表达后,Western blot结果发现,Ⅲc的产生显著增加（P<0.01）。以上这些结果表明lncRNA-UCA1可通过结合hnRNPF参与调控FGFR2的可变剪接,进而影响Ⅲb、Ⅲc的产生及二者比值变化。3.4lncRNA-UCA1/hnRNPF/FGFR2 Ⅲc信号轴通过PI3K-AKT信号通路参与调控食管癌EMT进程Western blot结果显示,EMT标志蛋白ZO-1和E-Cadherin在lncRNA-UCA1过表达组（Lv-UCA1）表达显著高于阴性对照组（Lv-NC）,在lncRNA-UCA1干扰组（UCA1-shRNA）和hnRNP F干扰组（si-F）中表达显著高于相应对照组（Ctrl-UCA1和si-Ctrl）;N-Cadherin和Snail在Lv-UCA1组表达显著低于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和si-F组中表达显著高于相应对照组（P<0.05）;此外,Western blot发现PI3K-AKT信号通路中关键蛋白分子PI3K、AKT、P-AKT在Lv-UCA1 组表达显著低于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和 si-F组中表达显著高于相应对照组（P<0.05）;PTEN在Lv-UCA1组表达显著高于Lv-NC（P<0.05）,在UCA1-shRNA组和si-F组中表达显著低于相应对照组（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1/hnRNP F/FGFR2 IIIc信号轴可能通过PI3K-AKT信号通路来参与调控食管鳞癌EMT进程。4.LncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴在食管癌发生发展机制研究4.1基于TCGA数据库构建lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络利用TCGA数据库中173例食管癌病人的RNA测序数据,筛选出在食管癌组织和癌旁正常组织之间具有统计学差异的miRNA共82个,其中上调35个,下调47个;差异mRNA共1398个,其中上调725个,下调673个;选择有统计学差异的上调miRNAs和下调mRNAs,应用Targetscan和miRanda在线生物信息学预测软件进行分析,利用Cytoscape软件构建以lncRNA-UCA1 为核心的 ceRNA 共表达网络,结果发现miR-18a-5p,miR-196b-5p,miR-452-5p等7个miRNAs是lncRNA-UCA1为核心的ceRNA中重要节点。应过DLR实验对这7个miRNAs与lncRNA-UCA1结合能力进行初步验证,结果发现只有miR-18a-5p,miR-196b-5p这两个miRNA的荧光信号值与对照比较具有统计学差异（P<0.05）;但仅有miR-18a-5p与对照组比较其荧光信号值显著降低（P<0.05）。这提示lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2作用轴可能与食管癌关系密切。4.2 LncRNA-UCA1可作为分子海绵吸附miR-18a-5pMS2-RIP联合qRT-PCR实验结果发现,在共转染GV127-MS2-UCA1和pMS2-GFP的实验组中可显著富集miR-18a-5p（P<0.05）,而在共转染GV127-MS2和pMS2-GFP的对照组中未见到miR-18a-5p的显著富集（P>0.05）;DLR实验结果发现miR-18-5p可显著减弱含有野生型lncRNA-UCA1的报告质粒的荧光信号值（P<0.05）,而不减弱含有突变型报告质粒的荧光信号值（P>0.05）。这表明miR-18a-5p可被作为“分子海绵”lncRNA-UCA1竞争吸附,进而有可能影响其靶基因SORBS2的表达水平。4.3 LncRNA-UCA1通过与SORBS2竞争结合miR-18a-5p参与肿瘤生长调控DLR实验结果显示miR-18a-5p可显著降低野生型pmirGLO-SORBS2（WT）的荧光信号值（P<0.05）,但不影响突变型pmirGLO-SORBS2（WT）的荧光信号值,这表明SORBS2是miR-18a-5p靶基因,二者可发生共价结合;qRT-PCR和Western blot显示,过表达lncRNA-UCA1可显著上调SORBS2水平（P<0.05）,干扰lncRNA-UCA1可显著下调SORBS2水平（P<0.05）;qRT-PCR显示SORBS2在EC病人的癌组织表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）;TCGA数据库中SORBS2在EC组织中表达显著低于癌旁组织（P<0.05）。CCK8挽救实验结果显示,共转染lncRNA-UCA1和miR-18a-5p于EC109细胞能部分挽救单独转染mi-18a-5p后对EC109细胞的促进生长能力;共转染miR-18a-5p和SORBS2和于EC109细胞能部分逆转单独转染SORBS2后对EC109细胞的抑制生长能力。这些结果表明,lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2作用轴在食管癌细胞体外增殖能力上发挥重要调控作用。5.LncRNA-UCA1在NMBA和MCLR诱发食管癌中作用机制初探5.1 LncRNA-UCA1在NMBA和MCLR致Het-1A细胞恶转过程中的表达特征QRT-PCR结果显示,与Blank组比较,NMBA、MCLR单独和联合染毒食管鳞癌EC109细胞12h、24h、48h、72h后lncRNA-UCA1表达水平均表达显著下调（P<0.05）;QRT-PCR结果显示,在NMBA和MCLR单独、联合染毒10代、20代发生恶性转化的Het-1A细胞中,NMBA与Blank组比较分别均显著下调2.42倍（10代和20代）（P<0.05）,联合组与Blank 比较,下调更显著,分别是3.84倍（10代）和14.29倍（20代）（P<0.05）。这些结果表明NMBA和MCLR可诱导lncRNA-UCAl在恶转Het-1 A细胞模型中表达下调,提示了lncRNA-UCA1参与NMBA和MCLR致食管癌发生发展过程。5.2 FGFR2 Ⅲb和Ⅲc通过PI3K-AKT信号通路参与NMBA和MCLR诱发食管癌EMTQRT-PCR结果显示,与Blank组比较,FGFR2 Ⅲb在NMBA组中表达上调2.35倍（P<0.05）;Ⅲc在NMBA组和MCLR+NMBA组中分别上调5.85倍和5.32倍（P<0.05）;Western blot结果显示,与Blank组比较,NMBA组中Ⅲb水平显著升高（P<0.05）,NMBA和NMBA+MCLR组中Ⅲc水平也显著升高（P<0.05）;Westernblot结果显示PI3K-AKT信号通路中的关键分子如PI3K,AKT,P-AKT蛋白在NMBA和NMBA+MCLR组显著上调（P<0.05）,PTEN蛋白在NMBA和NMBA+MCLR组表达显著下调（P<0.05）,这表明NMBA和MCLR可诱发PI3K-AKT信号通路的激活;Western blot结果显示,与Blank组比较,间质细胞标志N-Cadherin水平在NMBA组和联合组显著升高（P<0.05）,上皮细胞标志E-Cadherin水平在NMBA组和联合组显著下降（P<0.05）,这提示NMBA和MCLR可诱发EMT的发生。以上这些结果表明,FGFR2的可变剪接参与了PI3K-AKT信号通路的激活,并促进了NMBA和MCLR诱发食管癌EMT进程。5.3 LncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴参与亚硝胺和藻毒素诱发食管发生发展应用qRT-PCR技术对NMBA和MCLR单独和联合染毒致Het-lA发生恶转的20代细胞中分别检测了miR-18a-5p和SORBS2的表达情况,结果显示,与Blank组比较,miR-18a-5p在 NMBA、MCLR、NMBA+MCLR 组中表达均显著上调（P<0.05）,SORBS2 在 NMBA 和NMBA+MCLR组表达显著下调（P<0.05）;Western blot结果显示,SORBS2基因的蛋白表达水平在MCLR+NMBA组表达显著下调（P<0.05）。这些结果表明,lncRNA-UCA1/miR-18a-5p/SORBS2轴参与亚硝胺和藻毒素诱发食管发生发展过程。研究结论1.本研究通过芯片研究筛选出一个与食管癌发生发展密切相关lncRNA-UCA1,并发现lncRNA-UCA1在食管癌细胞和组织中均呈低表达,其低表达水平与食管癌发现风险负相关,且与淋巴结转移密切相关。2.本研究通过体内功能学实验证实lncRNA-UCA1过表达可显著抑制EC细胞的体外增殖、侵袭和迁移能力;动物整体实验研究发现,过表达lncRNA-UCA1能抑制EC细胞在裸鼠体内生长,并抑制EC细胞的远处肝转移,这提示lncRNA-UCA1在食管癌发生发展过程中发挥抑癌作用。3.本研究首次发现在食管癌细胞中lncRNA-UCA1与hnRNP F相互结合,进而发挥调控对FGFR2的2种可变剪接体IIIb和IIIc的产生,影响二者的比值,进而参与影响PI3K-AKT信号通路介导的EMT进程。4.本研究首次发现lncRNA-UCA1可通过对miR-18a-5p的封闭,部分解除对靶基因SORBS2的负性调控,促进SORBS2蛋白表达水平,从而发挥抑制食管癌细胞增殖的功能。5.本研究发现亚硝胺和藻毒素可抑制lncRNA-UCA1在恶转Het-1A细胞中的表达,一方面可通过以分子海绵的形式吸附miR-18a-5p,从而下调抑癌基因SORBS2的表达,进而促进肿瘤细胞的增殖;另一方面可通过lncRNA-UCA1/hnRNP F/FGFR2 IIIc参与激活PI3K-AKT信号通路介导的促食管癌EMT进程。