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【背景】根据WHO流感监测数据显示,2017年第45周至2018年第13周,在全球范围内,乙型流感病毒成为季节性流感的优势株,其中Yamagata谱系占据主导优势,对人群的健康带来一定程度的影响。针对流感的防治,西医主要通过注射流感疫苗进行免疫预防和使用化学药物阻断病毒的繁殖进程,中医药通过抑制病毒复制、调节机体炎症反应等多方面发挥作用。化学药物主要以神经氨酸酶抑制剂和M2离子通道阻滞剂为主,传统中药主要以单味中药和中药复方为主。反向遗传学对流感病毒的基因研究具有重要的意义。甲型流感病毒的反向遗传学技术平台已被广泛构建和应用,而乙型流感病毒的反向遗传学技术平台的成功构建却鲜有报道。【目的】本研究深入了解2017～2018年广州市流行的乙型流感病毒HA和NA的基因特征和流行原因,探索病毒序列新变异是否会引起病毒功能性改变,为流感监测防控和药物治疗流感提供科学依据。另外,构建乙型流感病毒反向遗传学平台,为乙型流感病毒基因研究和中药抗乙型流感病毒机制研究提供基础。【方法】一、采集2017年12月～2018年4月在广州市哨点医院的流感患者的咽拭子样本,应用免疫荧光法检测出乙型流感病毒样本后进行病毒分离培养和病毒RNA提取,通过一步法RT-PCR扩增病毒目的基因血凝素和神经氨酸酶,再进行基因序列测定和分析。二、根据序列比对分析的结果,选用神经氨酸酶基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行奥司他韦和帕拉米韦体外药物敏感性实验筛选,观察是否存在耐药性病毒株,以及使用连花清瘟胶囊进行体外抗病毒活性实验,观察奥司他韦、帕拉米韦与连花清瘟胶囊抑制病毒活性之间的差异。使用100TCID50的病毒量感染MDCK细胞后,分别加入连续半数稀释浓度的奥司他韦溶液、帕拉米韦溶液和连花清瘟胶囊溶解液,观察细胞病变和计算IC50值。三、根据序列比对分析的结果,选用血凝素基因上具有未报导过的氨基酸突变位点的9株病毒进行生长曲线实验观察病毒株之间增殖能力的差异。使用0.01MOI的病毒量感染MDCK细胞,分别在24h、48h和72h回收病毒上清液,再通过空斑实验来观察病毒株的增殖能力。四、使用pHW2000载体为骨架,构建包含各个病毒基因片段的8个重组质粒,将质粒混合后转染293T和MDCK混合细胞,培养后通过感染MDCK细胞进行病毒传代,进而完成乙型流感病毒的拯救。【结果】一、总共分离扩增2017～2018年乙型流感病例鼻咽拭子样本40份,成功分离出38株,初步鉴定出Yamagata系28株,Victoria系10株。对38株乙型流感病毒的HA、NA基因进行测序并构建进化树进行分析,（1）HA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒的HA基因均属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支,还有一个亚支为B/Wisconsin/1/2010类似株;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,其中以B/Hong Kong/286/2017和B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1、▲2）中未出现广州市流行株。（2）NA进化分析显示:28株Yamagata系乙型流感病毒中有27株的NA基因属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支;10株Victoria系乙型流感病毒均属于Victoria Clade 1A分支,以B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲2）中未出现广州市流行株,以B/Hong Kong/286/2017为代表的进化亚支Clade lA（▲1）中出现广州市流行株。另外,发现了病毒株B/Guangdong/GZ20/2018毒株为BY-HA/BV-NA系间重配病毒。对38株乙型流感病毒进行HA、NA氨基酸序列分析,（1）HA氨基酸序列分析:28株Yamagata系病毒株（包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有11个氨基酸位点发生突变,28株均携带L187Q和M266V突变;另外,发现突变位点S93P、R151K、N179K、P342S、V421A、N436S、T547I。B/Guangdong/GZ14/2018毒株缺失第540位氨基酸。B/Guangdong/GZ40/2018毒株发现T136I位点突变,位于120环抗原表位上。10株Victoria系病毒株共有7个氨基酸位点发生突变,10株均携带I132V、N144D和A214T突变,其中I132V位于抗原表位120环上,N144D位于抗原表位150环上;另外,发现突变位点A169T、K227R、N248D和P343S。（2）NA氨基酸序列分析:27株Yamagata系病毒株（不包括B/Guangdong/GZ20/2018）共有22个氨基酸位点发生突变,26株（96.3%）携带I49M突变,19株（70.4%）携带R65H突变,24株（88.9%）携带I171M突变,25株（92.6%）携带D342K突变,另外两株病毒B/Guangdong/GZ16/2018和B/Guangdong/GZ34/2018在342位点则携带D342N突变,27株（100%）均携带K373Q突变,17株（63%）携带S402P突变;另外,发现突变位点I6T、F12L、V45I、P48S、A67V、A67T、G70E、P76L、N144S、R186I、F266L、E308G、R315K、T372N、T389I、K419E、T437I。10株Victoria系病毒株和系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018共有12个氨基酸位点发生突变,11株均携带I120V、K220N、S295R、N340D、E358K突变,8株（73%）携带D384G突变,3株（27%）携带V401I突变;另外,发现突变位点P48T、T106I、I262M、M369V、V422I。二、所选取的9株病毒株中有5株存在不同程度的耐药性,而且5株病毒均属于Yamagata谱系。连花清瘟胶囊对其中4株耐药性程度较大的病毒株和药物敏感性参考株的体外活性抑制作用相近。三、Yamagata谱系病毒株B/Guangdong/GZ19/2018、B/Guangdong/GZ23/2018、B/Guangdong/GZ24/2018、B/Guangdong/GZ28/2018和B/Guangdong/GZ29/2018具有比B/Guangdong/GZ40/2018更强的增殖能力;Victoria谱系病毒株B/Guangdong/GZ39/2018的增殖能力比B/Guangdong/GZ11/2018更突出;系间重配株B/Guangdong/GZ20/2018的增殖能力弱于其他8株病毒。总体而言,Yamagata谱系病毒株在增殖能力上比Victoria谱系病毒株更强。四、成功构建乙型流感病毒反向遗传学平台。【结论】2017～2018年度WHO推荐的三价流感疫苗株未能对广州市人群形成良好的保护作用。因此,须密切关注乙型流感病毒的变异情况以及和疫苗株的匹配度,以便及时制定合理的疫苗更新和接种方案,对流感进行科学有效的防控。流行株中存在的对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和帕拉米韦产生耐药性的现象,以及耐药株和药敏株之间存在未报导过的氨基酸突变位点,而连花清瘟胶囊发挥传统中药的优势,对耐药性病毒株具有稳定的抗病毒活性作用。另外,Yamagata系流行株具有比Victoria谱系流行株更强的增殖能力,而不同谱系的毒株之间的增殖能力也存在一定的差异,并且,不同谱系的病毒株之间存在未报导过的氨基酸突变位点。其中的机制需进一步验证。