论文部分内容阅读
前列腺癌(Prostate cancer,PCa)成为世界范围内男性的第二大导致死恶性肿瘤疾病,前列腺癌也在发达国家是最为常见的恶性肿瘤之一,近几年以来前列腺癌在中国大陆的发病率急剧呈上升。前列腺癌疾病具有较高的发病率和死亡率。前列腺癌疾病一旦发生淋巴结或者(和)其他组织器官转移,患者的病情预后不良,患者的总生存期非常短。当今世界中已经拥有了许多成熟的治疗前列腺癌的手段,例如等待观察和主动监测、外科手术切除、放射科放疗、内分泌治疗、化疗等。其中雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)方法是治疗前列腺癌最有效的方法之一,但是许多患者在治疗过程中会产生耐药性,最后会因生化复发发生疾病进展,导致去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC)疾病的发生,治疗很困难,众多患者都发生在转移性去势抵抗性前列腺癌阶段而导致死亡。阐明CRPC进展过程的信号通路作用机制及耐药作用机制可为新的治疗方法提供可靠的科学依据。我们将提到的P21蛋白活化激酶2(PAK2)为Rho家族里GTP酶的下游效应器,PAK2可以调控细胞的增殖细胞学行为,在细胞的运动及细胞的凋亡等许多过程中起到了非常重要的作用。倘若PAK2的功能出现了异常时,就会导致多种的疾病(包括肿瘤)的发生和进展可能。目前已经有了相关实验研究PAK2可以参与前列腺癌疾病的进展过程,但是机制尚不是特别的清楚。有待我们工作中进一步深入研究,这为我们课题开展提供了理论支撑及帮助。目的为了研究P21蛋白活化酶2(PAK2)在前列腺癌中的表达水平情况,并且我们分析了PAK2与前列腺癌患者临床病史资料及前列腺癌进展的相关性。我们的课题通过了体外实验观察PAK2表达水平影响前列腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭等细胞生物学行为,进一步研究及分析PAK2磷酸化激活KRAB相关蛋白1(TRIM28)促进前列腺癌进展的相关性,通过体内、外实验人为干扰对其信号通路重要作用因子在前列腺癌细胞增殖和迁移及侵袭的影响。阐明PAK2在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)进展中的作用关系,探讨PAK2磷酸化激活TRIM28通路在前列腺癌进展中扮演了一个非常重要的角色,为疾病CRPC治疗提供我们新的方法和思路。方法我们通过了使用ONCOMINE数据库预测PAK2在前列腺癌组织和正常前列腺组织中的表达差异。分别采用了Western Blot和RT-q PCR检测PAK2在收集的临床样本(前列腺增生组织和前列腺癌组织,癌旁组织和前列腺癌组织)中的表达差异。采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测PAK2在前列腺增生组织、激素性前列腺癌(androgen dependent prostate cancer,HNPC)组织和去势抵抗性前列腺癌(CRPC)组织中的表达差异,通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库预测PAK2的不同表达水平对患者无病的影响差异。使用医学统计学方法收集、整理、分析统计140例前列腺癌患者的临床病理特征与PAK2的关系。体外实验培养前列腺癌细胞(LNCa P、C4-2、PC3)及前列腺增生细胞(BPH)采用Western Blot方法检测PAK2在相关细胞系间的表达差异。分别采取si RNA或者sh RNA、过表达慢病毒或者过表达质粒在C4-2细胞系中敲低或敲除及过表达PAK2观察C4-2细胞的细胞学行为的变化。同时使用PAK2的抑制剂处理C4-2细胞同样观察对C4-2细胞的细胞学行为的影响及变化。采用Western Blot方法分别验证对PAK2干扰的效果,采用MTT及克隆形成实验检测实验组和对照组细胞之间的增殖差异,应用Transwell实验观察实验组和对照组间的细胞迁移及细胞侵袭差异。利用GEPIA、Gene Cards及PROMO三个数据库预测TRIM28与PAK2在前列腺癌中的相关性。应用组织学免疫荧光(immunofluorescence,ICC)实验检测TRIM28与PAK2在前列腺增生组织和前列腺癌组织中表达的关系及表达部位。采用Western Blot方法检测PAK2表达水平的不同对TRIM28的磷酸化水平的影响。应用细胞学免疫荧光实验检测不同浓度的PAK2抑制剂PF-3758309处理细胞的TRIM28和PAK2表达相关性,通过小鼠体内皮下种植瘤实验检测对照组(DMSO)和实验组(PF-375809)对肿瘤生长的影响。应用荧光素酶报告基因实验检测前列腺癌细胞在不同条件处理下的SOX2启动子区活性差异。采用Western Blot方法检测不同组种植瘤中PAK2、p TRIM28、TRIM28、SOX2及Ki67等相关蛋白的表达差异情况。结果在数据库ONCOMINE中显示,PAK2在前列腺癌组织中的表达水平比正常前列腺组织的表达水平高,与我们收集的临床组织中的检测结果一致。PAK2在前列腺癌组织中的RNA表达水平高于癌旁组织的表达水平。同样PAK2在前列腺癌组织中的蛋白表达水平高于癌旁组织的表达水平。免疫组织化学结果显示PAK2在前列腺增生组织、激素性前列腺癌组织和去势抵抗性前列腺癌组织中的表达水平逐渐升高。TCGA数据库显示,前列腺癌患者中PAK2低表达水平较高表达水平有一个较长的无病生存期。患者临床资料统计分析得出PAK2的表达水平与患者的PSA水平、Gleason评分、临床分期、病理分级、转移、总生存期及疾病的生化复发情况密切相关,患者的PSA水平越高,Gleason评分越高,临床分期及病理分期越高,PAK2的表达水平越高,患者越容易发生转移及生化复发,患者的生存期越短,反之亦然。体外实验显示,PAK2的表达水平较LNCa P、BPH、PC3在C4-2中最高,在BPH中表达水平最低。在C4-2细胞系中稳定过表达PAK2发现细胞的增殖能力及细胞迁移、侵袭能力显著增强。随着PAK2抑制剂PF-3758309的浓度增加其细胞的细胞增殖能力及细胞迁移、侵袭能力逐渐减弱。GEPIA、Gene Cards及PROMO三个数据库显示,PAK2与TRIM28呈正向相关性。组织免疫荧光结果显示,PAK2和TRIM28的表达水平在前列腺增生组织、激素性前列腺癌组织及去势抵抗性前列腺癌组织中逐渐升高,而且PAK2和TRIM28共同表达在细胞核内。PAK2的表达水平与p TRIM28的表达水平呈正相关。随着PAK2抑制剂PF-3758309的浓度增加,PAK2和TRIM28的表达水平逐渐降低。在小鼠种植瘤中应用PAK2抑制剂PF-3758309组的肿瘤大小明显大于DMSO对照组的肿瘤大小,荧光素酶报告基因实验显示,只转染PAK2过表达组的SOX2启动子区活性最高。而转PAK2过表达及敲低TRIM28组的SOX2启动子区活性低于只转染PAK2过表达组,但是明显高于对照组。在都转染过表达TRIM28实验中,使用PAK2抑制剂PF-3758309组的SOX2启动子区活性较对照组明显减弱。使用PAK2抑制剂PF-3758309的肿瘤组织中PAK2、p TRIM28、TRIM28、SOX2及Ki67等相关蛋白的表达水平显著降低较DMSO对照组。结论PAK2在前列腺癌中表达水平显著高于癌旁的正常组织,在CRPC中表达水平最高,并且PAK2的表达水平与患者的PSA水平、Gleason评分、临床分期、病理分级、转移、总生存期及疾病的生化复发情况密切相关,与患者年龄无关。PAK2表达水平可以影响SOX2的表达水平,说明PAK2可能调节肿瘤细胞的干性,以至于来影响疾病进展,PAK2可以磷酸化激活TRIM28,活化的TRIM28可以增强SOX2启动子区的活性,使肿瘤细胞的细胞学行为更为活跃。