论文部分内容阅读
沙门氏菌（Salmonella）是引起食源性疾病的首要因素，被全世界认为是首选控制的食源性致病菌之一。人和动物感染Salmonella后可引起严重的胃肠炎导致食物中毒，感染严重者还能导致其死亡，是危害人类健康的重大隐患，造成了巨大的经济损失。由于Salmonella表型特征并不稳定，因此利用表型分型所能获得的菌株之间韵相关信息并不详尽，无法鉴别生化特性、血清型相同的不同Salmonella菌株。为了能够更好地对Salmonella进行流行病学调查和溯源，更快地应对食品安全的紧急情况，具有高通量、灵敏度高、重复性好、便于推广等优点的分子分型技术将成为必需的技术。本课题利用两种基因分型技术分别对广西地区市售生鲜肉源的Salmonella优势血清型分离株进行基因分型，目的是寻找一种能够对食品污染的Salmonella进行快速溯源的分子技术。同时对近年来广西生鲜肉源Salmonella的喹诺酮类药物的耐药现状进行研究。 本课题选取实验室保存的2011-2016年从广西部分地区超市及自由市场售卖的生鲜鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉中分离的Salmonella两个优势血清型S.derby和S.agona之71株和21株进行基于肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC)的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的分析，并根据分离株的年份、地域及ERIC-PCR基因型选取13个代表菌株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)的分析。结果92株Salmonella分离株的ERIC-PCR的指纹图谱均在250bp处得到沙门菌属的特异性扩增条带;71株S.derby指纹图谱的相似系数在0.74～1.00之间，可分为6个基因型，其中Ⅰ和Ⅲ型为优势基因型，分别占了54.93％(39/71)和19.72％(14/71);21株S.agona指纹图谱的相似系数在0.68～1.00之间，可分为6个基因型，其中基因型A(28.57％，6/21)和B(33.33％，7/21)为优势基因型;进一步研究发现，同一市场里不同种类的肉品存在同一Salmonella的污染、同一市场里同种类的肉品存在不同的Salmonella的污染、同一市场里不同采样时间的同种类肉品存在同一Salmonella的污染等情况;MLST基因分型的研究结果表明，7株S.derby均为ST40(19-20-3-20-5-22-22)、6株S.agona均为ST13(3-3-7-4-3-3-7)。 本课题还对71株S.derby进行包括萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星5种常用喹诺酮类抗生素耐药性研究。首先，通过常规药敏纸片（K-B）法对菌株进行耐药表型的检测，然后对质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)之qnrA、qnrB、qnrS、aac(6)-lb-cr oqxA、oqxB、qepA共7种基因分别进行PCR检测，并对gyrA和parC基因的喹诺酮类耐药决定区进行测序并分析其氨基酸位点突变情况，最后将耐药表型与耐药基因进行关联分析。结果显示，71株受试S.derby对第一代的喹诺酮类药物萘啶酸之耐药性严重，耐药率为19.72％、不敏感率为43.66％;对第三代的环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星敏感（敏感率分别为71.83％、74.65％、70.42％），但其中介率也比较高(分别为23.94％、25.35％、25.35％);对第四代的加替沙星则最敏感（敏感率为84.51％），中介率为14.08％。有76.06％(54/71)的菌株检测到了PMQR基因，其中oqxA检出率最高(53.52％)、oqxB检出率次之(49.30％)、qnr与aac(6)-Ib-cr的检出率相近，分别为29.58％(21/71)、25.35％(18/71)，qnrA与qnrB基因检出率较低，分别为4.23％(3/71)、5.63(4/71)，未检测到qepA基因;携带2种PMQR基因菌株的的百分比最高，占菌株数的32.39％(23/71)，有12.68％(9/71)、11.27％(8/71)的菌株分别携带3种、4种PMQR基因，oqxA和oqxB两种基因与对萘啶酸耐药的表型符合率较高，都达到了70％以上，aac(6)-lb-cr和qnrS基因的符合率都在40％左右;14株对萘啶酸耐药的菌株中，有92.86％(13/14)的菌株在gyrA或parC两个基因共检测到21个氨基酸突变位点，其中gyrA的D87N和S83I两个位点突变分别有35.71％(5/14)和21.43％(3/14)，parC的主要位点突变为T57S(42.86％，6/14)和T57V(21.43％，3/14)。 本课题研究结果证明，广西地区生鲜肉源Salmonella基因型呈现多样性，表明Salmonella的污染源广泛;ERIC-PCR分型技术可用于生鲜肉污染的Salmonella之溯源;Salmonella对喹诺酮类的耐药现象较严重，gyrA和parC基因的位点突变是Salmonella对喹诺酮类药物产生耐药的主要机制，而PMQR基因的携带也是Salmonella产生耐药的一个重要机制。