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研究背景与目的肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是发病率高、恶性程度高、预后差的恶性肿瘤,其发病机制涉及多基因调控、多信号通路参与,是一个复杂的网络体系,其根源是基因表达异常。肝癌的传统治疗效果不理想,免疫治疗和基因治疗现已成为研究热点,在肝癌中异常表达的基因是其理论基础的核心。发现和研究新的具有应用前景的肿瘤相关基因仍是肿瘤研究的重要领域和难题。聚焦于肝癌相关基因的研究有望为肝癌的早期诊断、分子免疫治疗及预后分析提供有力的工具。对肝癌相关基因功能机制的深入研究不仅能丰富肝癌发生发展的分子机制和理论体系,更重要的是为肝癌的临床诊断和治疗提供有力的标志物和靶点。HTA基因是本实验室通过生物信息学方法筛选得到的新肝癌相关基因,前期实验结果表明HTA基因不仅是一种特异性较强的肿瘤标志物,而且在肝癌的发生发展中起促进作用,故有望将其应用于肝癌的诊断和免疫治疗。同时,正因为HTA基因是从EST文库中新筛选发现的肝癌相关基因,前期研究只对其表达的特异性和促癌作用有了初步认识,但是关于该基因结构和功能机制方面的研究尚未开展,因此,本课题拟通过RACE和Northern blot等方法克隆HTA基因的全长并对其进行结构分析,对HTA基因编码的蛋白进行表达、纯化并制备单抗,用过表达手段研究HTA基因在肝癌细胞系的中的功能,并结合基因芯片、酵母双杂交、western blot等多种细胞生物学、分子生物学、生物信息学、实验动物学等研究手段和策略深入探讨HTA基因在肝癌中的作用机制。方法(1) RACE PCR扩增HTA基因的全长并对其基因结构、可变剪接进行分析,对其编码蛋白的特点进行预测。Northern blot检测HTA不同转录本在肝癌细胞系及正常细胞系中的表达。(2)构建原核表达载体,在大肠杆菌Rosetta中表达GST-HTA融合蛋白,用GST琼脂糖凝胶对融合蛋白进行纯化并用凝血酶切除GST标签,获得具有生物活性的HTA蛋白。以HTA蛋白为抗原,用杂交瘤技术制备单克隆抗体并鉴定。以该抗体用于western blot、免疫细胞化学检测HTA在肝癌细胞中的表达,并初步研究HTA抗体抑制肝癌细胞系增殖的生物学功能。(3)构建HTA真核表达载体,在肝癌细胞系HepG2及HTA表达量较弱的肝癌宿主肝细胞系QSG-7701中稳定过表达HTA基因,通过细胞增殖实验、细胞周期检测、克隆形成实验、裸鼠成瘤实验等体内外实验检测HTA基因过表达对肝癌细胞系生物学表型的影响。(4)以干扰HTA基因前后的HepG2细胞系总RNA为材料,全基因组表达谱芯片杂交筛选HTA相关差异基因。生物信息学GO分析和pathway分析HTA的相关差异基因及信号通路,实时荧光定量PCR和western blot检测感兴趣的HTA相关差异基因,明胶酶谱实验、细胞粘附实验、侵袭转移实验等进一步验证HTA基因的生物学功能。(5)以HTA蛋白为诱饵,在标准化人cDNA文库中,用酵母双杂交方法筛选HTA的相互作用蛋白。结合生物信息学对筛选出来的HTA相互作用蛋白进行结构功能分析及其与HTA蛋白结合位点契合度分析,挑选感兴趣的相互作用蛋白,进一步用特异性双杂交、免疫荧光实验检测两者在细胞中的定位情况。结果(1) RACE PCR扩增得到HTA基因1414bp的全长序列。进一步分析HTA编码蛋白阅读框含有3个外显子,2个内含子,而经HTA基因全长验证,第二号内含子存在可变剪切。Northern blot结果显示HTA基因在肝癌细胞系HepG2、QGY-7703中表达,而在正常细胞系HUVEC和正常肝细胞系L-02中均不表达。检测到的HTA转录本和全长扩增所得序列长度一致。(2)经原核表达、纯化得到了36kD大小的GST-HTA融合蛋白。凝血酶去除GST标签后得到了10kD左右的HTA蛋白。以此为抗原制备了HTA单克隆抗体并纯化,经检测该抗体(1mg/ml)效价为1：10000,可用于western blot和免疫细胞化学检测肝癌细胞系中HTA的表达。且HTA抗体对肝癌细胞系生长有抑制作用。(3)过表达HTA的肝癌细胞系生长增殖速度加快,克隆形成能力增强。细胞周期进程加快,在裸鼠体内的成瘤能力增强,在裸鼠皮下形成的肿瘤中,过表达HTA细胞系肿瘤组织中HTA的表达量较高,且形成的肿瘤恶性程度较高。(4)干扰HTA前后的肝癌细胞系HepG2中,多个与肿瘤发生发展相关的基因表达发生了变化,其功能涉及生长、增殖、代谢等多个功能领域,经qPCR和western blot验证,HTA的差异表达引起了一些金属蛋白酶类基因家族成员的表达变化,ADAM9、ADAM12、 ADAM10、ADAM17、MMP9、MMP2等多个因子的表达与HTA的表达量同步变化。明胶酶谱实验检测到MMP2和MMP9的活性在干扰HTA基因之后明显下降。细胞粘附、侵袭、迁移实验结果显示HTA基因能够增强肝癌细胞粘附、侵袭和转移能力。(5)酵母双杂交筛选出一批可能与HTA相互作用的蛋白。在蛋白结构位点分析基础上进行特异性双杂交及细胞免疫荧光实验,结果显示HTA蛋白能与LRP1相互作用,且者共定位于细胞膜和胞质。结论(1)克隆了新肝癌相关基因HTA的全长并通过Northern blot验证。(2)得到了具有生物学活性的HTA蛋白,制备了高效价的HTA单克隆抗体。(3)过表达HTA基因能促进肝癌细胞系的生长、增殖能力及体内成瘤能力。(4)金属蛋白酶家族多个成员与HTA基因的表达呈正相关,HTA可能通过该家族成员的表达影响肝癌细胞的粘附、侵袭、转移能力。(5)HTA与LRP1相互作用且共定位于细胞膜和胞质。