氮元素对地球上的生命是至关重要的。农业生产中，氮肥是施用量最大的化肥种类，其中尿素是主要的氮肥形式之一。土壤中的尿素主要来源于尿素化肥的施加，以及动物的排泄物。在自然环境中，尿素的半衰期很短，会被快速分解成为无机氮，但是仍有少量尿素残留于土壤之中。长期以来，人们认为尿素可以自由扩散进入植物细胞。随着研究深入，人们发现植物具有低亲和力和高亲和力两种吸收尿素的途径。其中，低亲和力的途径由水通道蛋白介导;而高亲和力的途径由尿素转运蛋白DUR3介导。研究发现，拟南芥中的DUR3具有14次跨膜结构域，属于钠/溶质共转运蛋白SSS(sodium-solute symporter)超家族，以主动运输的方式转运尿素，其转运尿素的能力呈现饱和的动力学模型，DUR3在转录和翻译水平都受到不同氮源的调控。目前，对于DUR3的研究，主要集中在水稻、玉米等多个物种中DUR3的生理功能、表达模式和调控等方面。然而，DUR3在细胞学水平上对外界环境中氮营养变化响应模式，特别是DUR3在细胞质膜上蛋白动力学特征还未见报道。本研究通过可变角全内反射荧光显微镜术(variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM)，结合单颗粒示踪技术，揭示了拟南芥尿素转运蛋白DUR3在响应外界氮营养变化时的质膜时空分布，同时通过与不同亚细胞定位的转基因拟南芥荧光标记株系的杂交，观察了在外界营养变化时细胞内DUR3的亚细胞定位，明确了胞内囊泡转运模式。主要实验结果如下:　　1.获得了荧光标记的DUR3-EGFP转基因拟南芥株系。构建了自身启动子驱动的pDUR3∷DUR3-EGFP植物表达重组质粒，将其转入dur3-1突变体，获得了单拷贝插入的DUR3-EGFP转基因拟南芥株系。突变体表型恢复实验结果显示，DUR3-EGFP转基因植株能够在尿素培养基上生长，证明突变体中表达的DUR3-EGFP具有转运尿素的生理活性。激光共聚焦显微镜下观察显示，DUR3在转基因拟南芥中的表达具有组织特异性，主要表达于根部表皮的细胞质膜上。　　2.分析了细胞质膜上DUR3-EGFP响应氮源变化的动力学特征。通过VA-TIRFM观察，发现DUR3-EGFP在细胞质膜上呈均匀的点状分布模式。利用单颗粒示踪(single particle tracking，SPT)技术追踪DUR3-EGFP荧光点的运动轨迹，发现DUR3-EGFP在质膜上存在侧向扩散，且表现出四种类型的运动模式，进一步测算了DUR3-EGFP运动的动力学参数，以尿素为唯一氮源时，DUR3-EGFP的扩散系数为9.65±1.54×10-4μm2/s，运动范围为短距离的0.198±0.052μm和长距离的0.318±0.064μm。而在以NH4NO3为无机氮源的条件下，DUR3-EGFP的扩散系数增加至1.96±0.10×10-3μm2/s，运动范围增加至短距离的0.369±0.048μm和长距离的0.620±0.049μm。　　3.探究了质膜上DUR3的寡聚化变化规律。本研究通过定点突变将GFP的第206位丙氨酸突变为赖氨酸，获得了单体性质更好的单体GFP(monomeric GFPA206K)，进一步利用豆蔻酰基化修饰将mGFPA206K定位在细胞质膜上，选择了拟南芥内源启动子驱动myristoyl-mGFPA206K的表达，筛选获得了作为寡聚化分析中单体GFP对照的myristoyl-mGFPA206K转基因拟南芥株系，通过漂白步数分析和荧光强度分布统计确定了单体GFP的荧光特征基线。进一步结合荧光强度分布和漂白步数分析，发现DUR3-EGFP在质膜上以单体和二聚体的形式存在，并且二者之间的比例随细胞外氮营养条件的改变呈现动态变化。以低浓度尿素为唯一氮源时，DUR3-EGFP二聚体所占比例为12.1％，而在以NH4NO3为无机氮源的条件下，DUR3-EGFP二聚体所占比例为38.4％。无机氮源条件下，DUR3的二聚体比例增高。　　4.揭示了拟南芥通过胞吞和囊泡转运调控DUR3对氮源变化的响应机制。通过去雄杂交获得了DUR3-EGFP和细胞内膜系统红色标记的双色荧光标记材料。荧光共定位分析结果显示，DUR3-EGFP经过网格蛋白介导的胞吞途径胞吞，并定位于于早期内涵体上，这一过程对早期内涵体-晚期内涵体特异阻断剂布雷菲德菌素A(BFA)处理是敏感的。与此相应，无机氮或高浓度尿素条件处理下，DUR3-EGFP通过囊泡转运至晚期内涵体，而蛋白免疫印迹结果显示，在无机氮或高浓度尿素条件下DUR3会被部分降解。　　综上所述，本研究通过单颗粒示踪和胞内转运途径分析，以高时空分辨率的方式揭示了拟南芥DUR3响应外界氮营养条件变化的蛋白动力学变化规律，以及囊泡转运对尿素转运活性的调控机制。研究发现:(1)当环境氮源从尿素转变为无机氮源时，DUR3-EGFP的扩散加快，范围变广;(2)质膜上的DUR3存在单体-二聚体的动态平衡，以无机氮为氮源时，DUR3在质膜上趋向形成二聚体并维持在较高的比例;(3)以无机氮为氮源或高浓度尿素条件下，DUR3会经网格蛋白介导的途径胞吞，经早期内涵体转运至晚期内涵体，并最终在细胞内被降解。这些结果表明，DUR3的生理活性与其在质膜上的运动和聚合状态密切相关。植物细胞可以通过调节DUR3在质膜上的运动和聚合状态，及胞内囊泡转运途径，从而实现对氮营养条件变化的适应，合理吸收外界氮营养。