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由胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶树减产的主要原因之一。目前,关于橡胶树胶孢炭疽菌的致病机制的研究还十分有限。效应蛋白是病原真菌的主要致病因子之一。通过生物信息学分析,我们预测到了一个编码候选效应蛋白的基因,将其命名为CgCP1,并对其进行了鉴定和功能研究,主要结果如下:1、通过RT-PCR技术克隆了该基因的编码区序列,测序结果表明编码区序列含有一个678bp的开放阅读框(ORF),编码226个氨基酸的肽链。生物信息学分析结果显示,CgCPl蛋白是Cerato-platanin蛋白家族的一个分支,含有一个N末端信号肽序列(1-19aa),一个Cerato-platanin蛋白家族特有的Cerato-platanin保守结构域(36-132aa)和一个 C端保守的 13 肽基序(apopolysialoglycoprotein,ApoPSGP)。2、通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgCP1基因的敲除突变株ΔCgCP1 及互补株 Res-ACgCP1。3、通过对野生型菌株WT、ΔCgCP1和Res-ACgCP1的生长情况和孢子产量进行分析,发现WT、ΔCgCP1和Res-ACgCP1的孢子产量存在显著差异,其中WT和Res-ΔCgCP1菌株显著高于ΔCgCP1,但三者生长速率没有明显差异。以上结果表明,CgCP1影响胶孢炭疽菌孢子产量,但不影响胶孢炭疽菌的生长。4、不管是固体培养或是液体培养,WT、ACgCP1、Res-ACgCP1菌株的颜色均存在明显差异,经黑色素含量测定,发现ΔCgCP1中的黑色素含量显著低于WT和Res-ACgCP1菌株,而WT和Res-ACgCP1中的黑色素含量没有明显差异,说明CgCP1基因影响了胶孢炭疽菌中黑色素的合成。通过对与胶孢炭疽菌黑色素合成途径相关基因Cg3HNR和CgLAC1的表达水平分析,我们发现两种基因在ACgCP1的表达显著低于WT和Res-ΔCgCP1,暗示CgCP1基因对胶孢炭疽菌中黑色素合成的影响与黑色素合成途径相关基因Cg3HNR和CgLAC1有关。5、通过对CgCP1蛋白中含有的4个磷酸化位点分别进行点突变并在ΔCgCP1中进行表达,获得发生不同磷酸化位点突变的互补突变株Res-ΔCgCP1-m1、Res-ΔCgCP1-m2 和 Res-ΔCgCP1-m3。分析发现,Res-ΔCgCP1-m1、Res-ΔCgCP1-m2 和Res-ACgCP1-m3在产孢能力上极显著低于WT,但与ΔCgCP1没有显著差异;同时Res-ΔCgCP1-m1、Res-ACgCP1-m2和Res-ACgCP1-m3的生长速度没有显著差异,但菌落颜色与WT相比颜色深浅不一。以上实验结果表明,CgCP1蛋白的磷酸化作用可能与胶孢炭疽菌的产孢能力和黑色素的合成调控相关,但与菌丝生长的关系不大。6、致病性分析结果表明,ΔCgCP1对橡胶树的致病性明显弱于WT和Res-ΔCgCP1,说明胶孢炭疽菌CgCP1基因的缺失导致其对橡胶树叶片的致病力显著下降,暗示CgCP1在胶孢炭疽菌对橡胶树的致病性中发挥作用。进一步通过机械穿透力分析发现,ΔCgCP1对玻璃纸的穿透能力受到损伤,暗示ΔCgCP1机械穿透力的损伤可能是ΔCgCP1致病力下降的原因之一。7、通过DAB染色的方法分析了 ΔCgCP1接种过程中对橡胶树叶片活性氧产生情况的影响,发现与野生型菌株接种结果相比ΔCgCP1接种后橡胶树叶片中活性氧的含量明显降低;同时通过橡胶树原生质体瞬时表达系统分析了 CgCP1对橡胶树细胞中活性氧产生情况,发现CgCP1蛋白可以诱导橡胶树原生质体细胞中活性氧的积累。8、通过qRT-PCR的方法分析了 WT、ΔCgCP1、Res-ΔCgCP1接种橡胶树对其防卫反应相关基因HbPR1和HbPR5表达的影响。结果表明ΔCgCP1接种的橡胶树叶片中HbPR1和HbPR5基因的表达水平显著低于WT和Res-ΔCgCP1接种的样品。9、通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统,我们发现CgCP1在烟草叶片中的表达能够引起烟草叶片产生坏死斑,且伴随着细胞死亡的发生,暗示CgCP1可以激活植物的过敏反应。10、构建CgCP1-GFP融合基因的瞬时表达载体,通过橡胶树叶片原生质体细胞瞬时表达系统对CgCP1蛋白进行了亚细胞定位分析,结果发现CgCP1蛋白定位于细胞膜和细胞质中,至于具体位置尚需进一步共定位检测加以确认。通过以上实验结果和分析,我们了解CgCP1蛋白的结构,初步明确了 CgCP1参与调节胶孢炭疽菌的孢子产量和黑色素合成、在胶孢炭疽菌对橡胶树的致病过程中发挥重要作用。此外,我们还分析了 CgCP1蛋白对植物先天免疫反应的激活作用,明确了 CgCP1蛋白能够诱导植物防卫反应基因的表达,使活性氧在植物细胞中积累,并诱导植物产生过敏反应。本研究对于阐明胶孢炭疽菌致病机理及其应用提供了新的证据。