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研究目的：研究噬菌体表面展示技术筛选的鸭乙型肝炎病毒(DHBV)多聚酶特异结合的模拟肽对DHBV感染的原代鸭肝细胞中DHBV复制的抑制作用。 研究方法： 1．绍兴麻鸭DHBV基因扩增，全序列测定。 2．噬菌体表面展示筛选用靶分子的制备：本课题选用两种靶分子，一是基因表达产物，根据测定的序列设计DHBV多聚酶(DHBVP)引物，PCR，把DHBVP分4段克隆入原核表达载体pGEM。测序鉴定正确后，转入表达菌株，以IPTG诱导表达并纯化；二是根据绍兴麻鸭DHBVP基因序列分析，合成包含核苷类似物作用位点YMDD的多肽作为靶分子。 3．噬菌体表面展示技术筛选DHBVP结合模拟肽：分别以分段表达的DHBVP和核苷类似物作用位点YMDD的多肽序列作为靶分子，以M13噬菌体7肽库进行筛选，将筛选3轮后得到的特异性噬菌体作序列测定，根据测定的序列合成模拟肽。 4．合成模拟肽对鸭乙型肝炎病毒抑制作用的研究：合成的模拟肽作用于体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞。分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清的DHBV-DNA。 5．真核表达模拟肽对鸭乙型肝炎病毒抑制作用的研究。将模拟肽序列克隆入真核表达载体后一起转入体外感染DHBV的鸭肝原代培养细胞并表达。分时段检测细胞核、细胞浆及培养上清的DHBV-DNA。 6．实验数据采用Kruskal-Wallis test统计分析。 结果： 1．用DNAssist拼接DHBV DNA的PCR产物测序序列。本研究所测绍兴麻鸭DHBV序列与NCBI公布上海麻鸭DHBV序列(Duck hepatitis B virus complete genome，from brown Shanghai duck，ACCESSION M32990 VERSION M32990.1 GI：325448)有72个位点有差异，同源性达97.62％；DHBVP有24个氨基酸有差异，蛋白质同源性达96.95％。 2．pGEM—DHBVP分段克隆测序与原序列相符，对码正确，所表达重组蛋白的相对分浙江大学博士学位论文子量与预计相符。 3.噬菌体展示技术筛选3轮后共筛到16条的模拟肤序列，根据模拟肤的同源性和理化性质分析，进一步筛选出7条模拟肤序列进行抑制DHBV的复制的研究。 4.鸭肝原代培养细胞在分离培养10天后，实验组与相对应的对照组形态学无明显差异。 5.在合成的模拟肤作用组中，阳性对照、3号肤、6号肤的上清及胞浆中的OHBV DNA含量低于阴性对照组(阳性对照，3号肤，6号肤vs阴性对照，P<0 .05)。胞内表达模拟肤作用组，阳性对照、6号肤的胞浆DHBV DNA含量低于阴性对照组(阳性对照，6号肤vs阴性对照，P<0 .05)。其余各组数据与其对应的阴性对照组相比，差异没有统计学意义(.!〕)0 .05)。 6.合成的模拟肚直接作用组对细胞DHBV DNA抑制率:阳性对照:97.4%、3号肤:93.40k、6号肤:97.1%。模拟肤直接作用组对胞浆DHBV DNA抑制率:阳性对照:96.4%、3号肚:77.7%、6号肤:88.9%。胞内表达模拟肚作用组对胞浆DHBV DNA抑制率:阳性对照:92.30k、6号肤:8 1.8%。 结论: 1.本研究所用绍兴麻鸭DHBV研究背景清楚，可以作为本研究的病毒模型。 2.DllBVP分段克隆测序与原序列相符，对码正确，所表达重组蛋白的相对分子量与预计相符，可以作为本研究的靶分子。 3.鸭肝原代培养细胞体外人工感染DHBV后，存在复制现象，可以作为体外抗DHBV药物筛选的模型。 4.在合成的模拟肤直接作用组中，3号肤(Leu一val一Thr一His一Thr一Pro一Ile)和6号肤(His一A!a一Ile一Tyr-Pro一Arg一His)对DHBV的复制有抑制作用，在胞内表达模拟肤作用组，6号肤对DHBV的复制有抑制作用，但各组对cccDNA均无抑制作用。