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目的:本研究以临床分离的致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）为材料,在inlA、inlB缺失基础上缺失inlJ构建三基因缺失株（Lm90-ΔinlABJ）,分析其部分生物学特性及对小鼠和绵羊的致病作用;应用Lm90感染小鼠,分析小鼠血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）通透性变化及发生损伤的可能作用机制,并构建体外BBB模型进一步验证炎性因子对小鼠BBB损伤的影响作用,为进一步研究单增李斯特菌（Listeria monocytogenes,L.monocytogenes）的致病机理及防控李斯特菌病提供参考,也为进一步开展其它细菌性脑膜炎病原菌感染中枢神经系统的研究提供一定借鉴。方法:（1）用Primer 5.0软件设计引物,PCR扩增inlJ基因上、下游同源臂,采用重叠延伸PCR获得缺失inlJ的融合片段ΔinlJ;构建重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,经电转化至Lm90-ΔinlAB感受态细胞,在温度及氯霉素双重压力下实现同源重组;筛选重组Lm90-ΔinlABJ,并检测其遗传稳定性。（2）采用细菌学方法对比分析Lm90-ΔinlABJ、Lm90-ΔinlAB及Lm90的生长特性、培养特性,并就细菌对细胞的侵袭能力和动物致病力等差异进行分析。（3）以致绵羊脑炎单增李斯特菌（Lm90）感染小鼠,通过临床症状观察、病理组织学检查、细菌回收等试验对小鼠感染模型进行评估,应用伊文思蓝法（Evan’s blue,EB）、蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）及免疫组化法分析小鼠感染后BBB通透性变化及紧密连接蛋白（Tight junctions,TJ）表达变化,并测定炎性因子水平,以探寻小鼠BBB损伤的可能作用机制。（4）原代分离培养新生小鼠脑微血管内皮细胞（Mouse brain microvascular endothelial cells,MBMEC）及星型胶质细胞（Astrocyte cells,AC）,并经形态学及免疫荧光鉴定;后应用共培养技术建立小鼠体外BBB模型,通过液面试漏实验、跨内皮细胞电阻（Trans-endothelial electronic resistance,TEER）、辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase permeability,HRP）测定以及WB检测TJ表达变化对BBB模型进行评价。后利用感染Lm90的RAW264.7细胞产物及白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）模拟L.monocytogenes感染导致的体内炎性环境作用于体外BBB模型,应用TEER和HRP通透率测定试验验证炎性因子对体外BBB模型通透性的影响,通过qRT-PCR、WB及细胞免疫荧光,分析炎性因子对BMECs间紧密连接的影响,并与小鼠体内感染试验相互验证。结果:（1）成功构建了重组穿梭质粒pKSV7-ΔinlJ,结合电转化及同源重组技术成功构建了可稳定遗传的inlJ基因缺失株Lm90-ΔinlABJ。（2）inlJ基因缺失不影响L.monocytogenes的生长速度,Lm90-ΔinlABJ体外培养与Lm90-ΔinlAB及Lm90均无差异;细胞感染试验表明Lm90-ΔinlABJ对MBMEC的黏附率和侵袭率分别为2.54%、0.22%,与Lm90相比差异具有统计学意义（P<0.05）;与Lm90-ΔinlAB相比,黏附率与侵袭率均无显著差异（P>0.05）;小鼠感染试验显示Lm90-ΔinlABJ的LD50较Lm90-ΔinlAB升高了0.3个对数数量级,较Lm90升高了1.6个对数数量级;载菌量测定试验表明感染72 h后Lm90-ΔinlABJ在肝和脾中的载菌量较Lm90-ΔinlAB分别下降0.57、0.26个对数数量级,相比Lm90则分别下降1.02、0.96个对数数量级,表明缺失株毒力下降。绵羊感染试验表明Lm90-ΔinlABJ依然具有致病力,可引起绵羊脑炎。（3）Lm90在小鼠脑中定殖具有时间依赖性,感染后EB法测定结果提示感染初期小鼠BBB通透性未发生明显变化,当小鼠严重发病、濒临死亡时通透性显著增加;WB和免疫组化显示Lm90感染可下调Occludin和Claudin-5表达来增加BBB通透性;ELISA测定结果表明小鼠感染后,脑匀浆及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达上调,结合小鼠BBB通透性的变化,推测小鼠感染后BBB表现损伤,通透性增加,可能是炎性因子上调表达导致了紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5下调表达。（4）成功分离得到了小鼠原代BMECs及AC,形态学观察BMECs呈典型的铺路卵石样,AC有细长突触,胞质较浅,且二者经免疫荧光鉴定均正确。BMECs与AC共培养后,液面试漏实验为阳性;TEER值在72 h趋于稳定且在96 h达到403Ω·cm-2;HRP通透性测定结果与TEER结果具有一致性;WB检测显示细胞间紧密连接蛋白高表达;Lm90感染可诱导RAW264.7细胞炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达上调,且感染Lm90的RAW264.7产物及IL-1β均可下调BMECs紧密连接蛋白的表达而使BBB的通透性增加,体外试验结果与体内相符。结论:本研究成功构建了三基因缺失株Lm90-ΔinlABJ且遗传稳定性良好,生物学特性研究结果显示inlA、inlB、inlJ缺失对其生长无显著影响作用,缺失株对细胞的侵袭力及小鼠致病性明显下降,但仍有致病力,依然可导致绵羊脑炎;Lm90感染小鼠后,BBB通透性在感染初期无明显变化,在小鼠感染后期及濒临死亡时增加明显,且BBB表现出损伤作用,其可能机制是炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）上调表达,引起了紧密连接蛋白（Occludin、Cludin-5）下调表达,且体外试验结果进一步予以了证实。