背景与目的慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系统的常见病和多发病,患病率和病死率均居高不下,严重影响患者的劳动力和生活质量。COPD造成巨大的社会和经济负担,根据世界银行/世界卫生组织发表的研究,至2020年COPD将成为世界疾病经济负担的第五位。在我国,COPD同样是严重危害人民身体健康的重要慢性呼吸系统疾病。近期对我国7个地区20245成年人群进行调查,COPD患病率占40岁以上人群的8.2%,其患病率之高十分惊人。COPD发病机制尚未完全明了,但吸烟是导致COPD的最常见原因。COPD病情呈进行性发展,病理学改变累及肺脏的多级结构,包括中央及周围的气道、肺实质乃至肺血管,属于不可逆性病变,依靠机体自身的能力无法达到组织的完全修复。根据COPD诊治指南,现有的可行性治疗方案包括药物治疗、氧疗、康复治疗及外科治疗,但现有的这些治疗手段仅仅从减轻症状,阻止病情发展；改善活动能力,提高生活质量出发。因此,迫切需要寻找到能够从根本上修复和重建肺部组织结构的的有效方法。间充质干细胞(MSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,国内外研究发现MSCs在特定条件下具有向中胚层(如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等)、外胚层(神经纤维等)和内胚层(如肺上皮细胞、肝细胞等)来源的多种组织细胞分化的能力,是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞。它不仅具有取材方便、培养容易、增殖较快等特点,免疫原性也较低,低表达MHCI、不表达MHCII,提示在进行同种异体间输注时,不会产生排斥反应。对MSCs的深入研究发现当有组织器官受损时,间充质干细胞能够优先定位于受损伤的靶器官,这与移植方式、移植途径和移植后的时间无明显关系。有研究报道,体外标记MSCs后将其移植入肺损伤的动物体内,MSCs可以大量定位到损伤的肺组织中,并能在损伤的肺组织内分化成肺泡上皮细胞。此外,它可以在损伤组织局部分泌一些营养因子、生长因子,这些细胞因子可能参与修复损伤的肺组织。目前对于慢性阻塞性肺疾病的治疗仅仅停留在缓解、改善的水平上,未能从根本上解决问题。本实验基于MSCs这些特性进行干预治疗,采用同种异体MSCs进行输注,研究MSCs治疗大鼠COPD的效果。实验方法第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定实验在无菌条件下分离大鼠肱骨、股骨,用无血清培养基冲出骨髓,离心后接种含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中,按2×106/cm2密度接种于培养瓶中,置于孵箱中培养。48h后半量换液,第五天全量换液,待细胞生长至80-90%融合时,0.25%胰酶消化传代。取生长状态良好的第三代骨髓间充质干细胞倒置显微镜和瑞士-吉姆萨染色观察细胞形态,流式细胞术进行细胞周期分析,用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD29及CD44的表达,进行细胞鉴定。第二部分大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立选取10只雄性SD大鼠随机分为两组,即对照组和模型组。模型组大鼠烟雾暴露80天,对照组常氧下饲养。80天后,水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉插管取血1ml送血气分析；苏木精-伊红染色(HE染色)观察大鼠肺部病理改变：平均内衬间隔(MLT)及平均肺泡数(MAN)评估肺气肿程度。第三部分MSCs治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究选取15只雄性SD大鼠随机分为三组,即对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组大鼠烟雾暴露80天,对照组常氧下饲养。其中治疗组大鼠在烟雾暴露80天后每只大鼠每周注射一次间充质干细胞,数量为3.6×106个,连续四周进行治疗,模型组和对照组大鼠同期尾静脉注射同等体积的生理盐水。常规饲养大鼠1月后,腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉插管取血1ml送血气分析；提取大鼠血清,制备肺组织匀浆,采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清和肺组织中MDA含量和SOD活性；行支气管肺泡灌洗,测支气管肺泡灌洗液中(BALF)白细胞总数及分类计数细胞；苏木精-伊红染色(HE染色)评估大鼠肺部病理改变,用平均内衬间隔(MLT)及平均肺泡数(MAN)评估肺气肿程度；从生理学、形态学、生化学等水平探讨MSCs是否具有治疗慢性阻塞性肺疾病的作用。第四部分MSCs向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织趋化的研究用PKH26标记P3代MSCs,荧光显微镜下观察细胞。瑞士-吉姆萨染色观察PKH26对细胞形态的影响；检测标记后的MSCs的生长曲线以了解PKH26对细胞的增殖的影响。分别经尾静脉输入PKH26标记后的MSCs3.6×106个到COPD及正常大鼠体内,同时输入同等量未标记的MSCs到另一组COPD大鼠体内作为阴性对照。一周后,处死大鼠,制作肺组织冰冻切片。荧光显微镜下观察。取大鼠肺组织,研磨后经300目筛网过滤,取肺组织1×106个细胞制作悬液涂片,在荧光显微镜下观察并计数,以探讨MSCs能否向慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺组织中趋化。统计学方法实验资料结果用均数±标准差(x±s表示,选取检验水准为α=0.05,采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。模型评价采用两独立样本t检验(Independent Sampies T-Test);评估治疗效果的组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA).标记后的细胞及未标记细胞随时间的增殖变化用配对样本t检验(Paired Sampies T-Test);用Levene进行方差齐性检验,组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett T3。结果第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定①本实验分离的骨髓间充质干细胞于48h后贴壁生长,全量换液后可见细胞呈星形、多边形和不规则形；10天左右时,细胞即可融合近80%。传代培养后细胞形态基本上趋于一致,经瑞士-吉姆萨染色后光镜下见细胞呈梭形,核圆,色紫蓝,位于细胞中央,胞质肥大,胞膜清晰；②流式细胞术证明GO+G1期的细胞约占80%以上,说明MSCs在体外具有只增殖不分化的特点；③经流式细胞仪检测,Cell Quest软件分析,结果显示第3代MSCs的特异性表面标志物：CD34-/CD45-/CD29+/CD44+,CD29+阳性率为99.9%,CD44+阳性率为97.8%；结合以上说明本实验培养的细胞为间充质干细胞。第二部分大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立①血气分析：检测动脉血氧分压(PO2)显示对照组和模型组分别为：83.00±6.94.72.20±5.404mmHg,模型组氧分压显著低于对照组(t=2.740,P=0.025)；二氧化碳分压(PC02)分别为37.00±3.16.40.8±7.36mmHg,两者比较无显著统计学意义(t=-1.060,P=0.320)。②病理观察：对照组镜下可见正常气管及各级支气管上皮纤毛丰富,排列整齐,在纤毛细胞间夹杂有少数杯状细胞,管壁内有少数散在的淋巴细胞。模型组肺体积较对照组增大,颜色苍白,部分肺表面可见多个大小不等的过度充气肺大疱。光镜下可见炎症细胞浸润,肺泡大小不等,肺泡壁变薄,并有不同程度的断裂,部分融合成肺大疱。③定量病理：结果显示对照组、模型组MLI分别为：45.86±3.45μm/个, 79.32±7.93μm/个,模型组肺MLI显著高于对照组(t=-25.638, P<0.001):MAN分别为：396.18±19.00个/m2,213.42±19.00个/m2,模型组MAN显著低于对照组(t=44.481,P<0.001)。第三部分MSCs治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究①观察大鼠的一般状态：对照组大鼠在实验过程中进食正常,毛发光滑,生长良好,无明显的呼吸道症状。模型组大鼠逐渐出现毛发脱落、萎黄、无光泽、反应迟钝、活动减少、呼吸频率增快并出现喷嚏、喘息等呼吸道症状。治疗组大鼠精神状态一般,毛发微黄,反应较模型组灵敏,呼吸道症状较模型组缓解。②血气分析检测动脉血氧分压(PO2)及二氧化碳分压(PCO2)结果显示：模型组氧分压显著低于对照组,而治疗组较模型组的氧分压显著增高(F=5.941,P=0.016)；对照组、模型组及治疗组二氧化碳分压组间比较无统计学差异(F=0.823,P=0.463)。③采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清SOD的活性及MDA含量,结果显示：对照组、模型组及治疗组血清SOD的活性分别为100.88±2.18U/ml,34.93±5.04 U/ml,80.91±6.70U/ml(F=67.941,P<0.001)；MDA含量分别为5.66±0.08nmol/ml、10.84±0.65 nmol/ml、5.78±0.22nmol/ml(F=50.288,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组进行两两比较,差异具有统计学意义。④采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测肺组织中SOD的活性及MDA含量,结果显示：对照组、模型组及治疗组血清SOD的活性分别为133.91±6.27 U/mg prot,100.45±4.03 U/mg prot,131.29±10.97 U/mg prot(F=50.726,P<0.001),MDA含量分别为5.32±0.80 nmol/mg prot,8.43±1.01 nmol/mg prot,5.43±1.07 nmol/mg prot(F=23.838,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义。⑤检测支气管肺泡灌洗液白细胞总数及分类计数结果显示：对照组、模型组及治疗组白细胞总数分别为1.85±0.2.0×10/L,4.27±0.74×10/L,2.23±0.416×108/L(F=39.546,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义；巨噬细胞总数分别为：1.68±0.2.0×108/L,3.36±0.69×108/L,1.98±0.39×10/L(F=23.088,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义；中性粒细胞总数分别为0.08±0.015×10/L, 0.61±0.096×10/L,0.13±0.020×108 /L((F=207.437,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义。⑥观察肺部形态学改变：模型组大鼠肺脏体积明显增大、膨胀,颜色苍白,弹性差,光镜下见炎症细胞浸润,肺泡大小不等,肺泡壁变薄,并有不同程度的断裂,部分融合成肺大疱,MSCs治疗组较模型组明显改善。⑦定量病理结果显示对照组、模型组、治疗组MLI分别为：45.03±3.66μm/个,79.67±8.291μm/个,56.90±4.31μm/个(F=409.599,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义；MAN分别为：407.48±19.32、206.30±23.38、331.27±24.939(106个/m2)(F=903.076,P<0.001),模型组与对照组、治疗组与模型组组间比较,差异具有统计学意义。第四部分MSCs向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织趋化的研究①PKH26标记骨髓间充质干细胞不影响细胞形态及细胞的增殖。②将间充质干细胞输入大鼠体内,在荧光显微镜下观察,输入标记后的MSCs的COPD及正常大鼠的肺组织中均可见红色明亮荧光,输入未标记的MSCs大鼠肺组织未见红色明亮荧光。计数荧光细胞进行组间比较(F=122.588,P<0.001),具有显著统计学差异。COPD组大鼠的荧光细胞数较正常对照大鼠显著增高。结论1、本实验方法能有效地获得骨髓间充质干细胞,采用贴壁法培养的骨髓细胞经鉴定为间充质干细胞。2、本实验采用的烟熏80天的方法能够成功构建大鼠COPD模型。3、本实验从生理学、形态学、生化等方面检测,发现MSCs能够起到改善和修复大鼠的慢性阻塞性肺疾病损伤的作用,说明骨髓间充质干细胞输注具有治疗大鼠慢性阻塞性肺疾病的效果。4. MSCs具有向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织趋化的能力。本研究的创新点：目前没有一种药物能够逆转或阻断慢性阻塞性肺疾病的进行性发展,本研究从具有多向分化潜能、具有免疫调节功能的多能干细胞MSCs入手,探讨治疗慢性阻塞性肺疾病的新方法。本研究的价值：本实验从MSCs多向分化潜能及其器官修复功能着手,研究同种异体骨髓MSCs输注对大鼠慢性阻塞性肺疾病的作用,可能成为治疗慢性阻塞性肺疾病的新手段,同时为MSCs的生物细胞治疗开辟了一个新的方向。