耐辐射奇球菌蛋白提取物合成双金属纳米颗粒及其降解多苯类染料的作用研究

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金属纳米颗粒由于其独特的纳米尺寸和特殊的理化性质,在生物、医药领域具有广泛应用。在多种合成方法中,微生物菌体及其提取物合成金属纳米颗粒,尤其是双金属纳米颗粒,具有生物相容性高、分散性好、比表面积大和功能多样性等优势,在新型药物载体、工业催化和环境治理等领域备受关注。极端微生物-耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)具有极强的辐射、氧化抗性和损伤修复能力。其胞内含有丰富的还原性物质,因而在生物合成功能化修饰的金属纳米颗粒方面具有重要应用潜力。本研究利用耐辐射奇球菌蛋白提取物直接介导合成金银双金属纳米颗粒,并综合利用生化与分子生物学、生物物理学、分析化学和纳米科学等多种方法对它的材料结构、表面特征、合成机制进行了研究,进一步探究了其在降解多苯类有毒染料方面的价值和应用潜力,并探讨了纳米颗粒功能相关蛋白的具体功能和作用机制。主要获得以下结论:1)生物合成了由耐辐射奇球菌蛋白提取物介导金属离子还原并包被的金银双金属纳米颗粒Drp-Au-AgNPs。合成过程先由蛋白质与硝酸银(AgNO3)溶液反应还原银离子生成Drp-AgNPs,再加入氯金酸(HAuCl4·3H2O)溶液反应,最后形成金银双金属纳米颗粒Drp-Au-AgNPs。利用X射线衍射(XRD)、动态光散射(DLS)、傅里叶变化红外光谱(FT-IR)和X射线光电子能谱(XPS)等手段表征了双金属纳米颗粒的特性。所合成的纳米颗粒呈球形,颗粒的平均水合粒径为149.8 nm,多分散性指数(PDI)为0.397±0.021;合成量和粒径大小受温度、pH等因素的影响。双金属纳米颗粒表面被耐辐射奇球菌蛋白包被(capping),并同时具有Ag和Au的特征晶面和合金的特点。耐辐射奇球菌蛋白质中的羟基和酰胺键、含磷含氧官能团以及质子化胺基都参与了金属还原过程。合成步骤为先将Ag(I)还原为Ag(0),再将Au(III)还原成Au(I)再进一步还原成Au(0)。Drp-Au-AgNPs在溶液中稳定性较好,常温下放置48小时的金属释放率分别为Ag%=16.17%和Au%=3.69%,该释放率在同类材料中较小;用25μg/mL的Drp-Au-AgNPs处理人类正常乳腺上皮细胞,细胞的存活率大于80%,表明其具有毒性较小、生物相容性较好的特点。2)Drp-Au-AgNPs对毒性多苯类染料具有降解和解毒能力。它能够将孔雀石绿(MG)、活性黑(RB-5)和番红O(SO)等多苯环类染料高效地脱色;与菌体、菌体蛋白提取物或单金属纳米颗粒处理比较,Drp-Au-AgNPs具有更高的脱色效率。气质联用(GC-MS)分析发现,Drp-Au-AgNPs将孔雀石绿(MG)苯环之间的中心碳键氧化断裂形成低毒产物4-(二甲基氨基)苯甲酮(4-DMABP),降解和解毒作用归因于Drp-Au-AgNPs上包被结合的蛋白;FT-IR和XPS等分析表明,蛋白的羟基、酰胺键、含磷官能团以及羧基可能参与和底物MG降解的作用。使用过的Drp-Au-AgNPs可以通过离心洗涤的方法循环再生,再生后元素组成、晶体结构、粒径大小等特征均基本保持不变。循环再生三次后,其降解能力可以保持在原始材料的60%以上。3)蛋白质质谱鉴定了Drp-Au-AgNPs表面包被蛋白,发现多种氧化还原相关蛋白和酶,它们可能参与合成金属纳米颗粒及其参与多苯类染料降解作用。其中DRA0145是一种C型脱色过氧化物酶DyP同源物,其序列中含有几个高度保守位点,如189位Asp与348位Arg等。此外,通过同源序列比对发现耐辐射奇球菌中存在一种广谱降解酚类化合物的多酚氧化酶-漆酶的同源物DR1966,可能也具有降解多苯类染料的功能。构建分子进化树,分析了这两种蛋白的进化特性。在过氧化氢胁迫下,突变株△drA0145和△dr1966较野生型生存率降低,说明该两种蛋白与耐辐射奇球菌的氧化抗性相关。将DRA0145和DR1966蛋白大肠杆菌中异源表达并纯化,证明了在体外DRA0145和DR1966均能直接降解孔雀石绿染料至低毒产物4-DMABP,其中DRA0145的降解率为91.86%,DR1966的降解率为80.10%。本论文研究了生物法合成耐辐射奇球菌蛋白提取物包被修饰的-金银双金属纳米颗粒,阐明了Drp-Au-AgNPs颗粒材料的表面特征和合成的机制,深入研究了Drp-Au-AgNPs降解并解毒多苯类染料的作用,探究了与降解多苯类染料相关的耐辐射奇球菌基因和蛋白,为功能化修饰的金属纳米材料合成和价值的研究提供了新的思路和理论参考。与菌体细胞相比,Drp-Au-AgNPs具有表面蛋白功能化修饰,在溶液中具有微生物-纳米颗粒的稳定性好和分散性佳、生物安全性较高等特性。研究结果将为耐辐射奇球菌介导合成的功能化修饰纳米颗粒等纳米材料在环境、生物医药等领域的应用提供支持。
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