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小麦是我国重要的粮食作物之一,其产量直接关系到国家粮食安全。由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst）引起的条锈病是我国小麦生产上最重要的病害之一,其流行性强,分布广,危害严重。种植和利用抗病品种是防治该病害最为经济有效的措施。由于条锈菌生理小种的频繁变异,导致抗病品种抗性不断“丧失”,从而引发病害大流行。因此,加强对小麦条锈菌致病机理的研究,进而拓展新的抗病策略,对持久防控条锈病具有重要的理论意义。小麦条锈菌作为活体营养型真菌,需要从活体细胞中吸收营养并向寄主中分泌效应子调控寄主免疫反应以促进侵染。由于缺乏稳定可靠的遗传转化体系,条锈菌重要效应子的致病机理研究相对滞后。前期筛选到一个富含丝氨酸效应子Pst27791能抑制Bax和条锈菌类激发子蛋白Pst322诱导的细胞坏死。本研究进一步利用异源表达、蛋白互作和小麦转基因等技术对Pst27791毒性功能及其调控小麦免疫的机理进行解析,获得了如下创新性结果。1.明确富含丝氨酸效应子Pst27791为条锈菌重要致病因子序列分析表明,Pst27791编码含有207个氨基酸的蛋白并含具有分泌功能的信号肽。定量分析发现Pst27791在条锈菌侵入期和活体营养寄生时期显著上调表达。在本氏烟中瞬时过表达Pst27791能抑制细菌鞭毛多肽flg22激发的活性氧迸发和防御相关基因表达。为明确Pst27791的毒性功能,进一步创制了Pst27791的过表达及RNAi转基因材料。Pst27791过表达材料对条锈菌抗性显著减弱,由条锈菌侵染引起的活性氧积累降低,水杨酸相关基因表达被抑制。Pst27791-RNAi（RNA interference）转基因材料对条锈菌抗性显著增强,条锈菌生长发育明显受到抑制,菌落面积减少,生物量降低。综上表明,Pst27791能抑制植物免疫促进病菌侵染,是条锈菌重要致病因子。2.揭示了Pst27791靶向小麦感病激酶Ta Raf46以抑制小麦免疫的机理为解析该效应子调控寄主免疫反应的机理,本研究通过酵母双杂交技术鉴定到Pst27791在小麦中的候选互作靶标Ta Raf46,并通过免疫共沉淀技术进一步明确了两者之间存在互作。序列分析发现,Ta Raf46编码含有373个氨基酸的激酶,属于Raf-like MAPKKKs亚家族成员并含有该亚家族典型的保守基序（GTXX（W/Y）MAPE）。在本氏烟中瞬时过表达Ta Raf46能抑制条锈菌类激发子蛋白Pst322诱导的细胞坏死以及flg22激发的基础免疫反应。借助BSMV-VIGS技术在小麦中瞬时沉默Ta Raf46显著抑制条锈菌生长。此外,在Ta Raf46沉默叶片上,条锈菌无毒性小种侵染引起的活性氧积累明显增多,Ta PR1/Ta PR2的转录表达增强。Ta Raf46过表达转基因材料对条锈菌抗病性减弱,小麦MAPK级联途径的激活被抑制。以上结果表明Ta Raf46在小麦-条锈菌互作中发挥负向调控植物免疫的作用。同位素标记的体外磷酸化实验证实Ta Raf46具有底物磷酸化和自磷酸化活性。进一步分析发现,Pst27791可能通过抑制26S蛋白酶体介导的降解来稳定Ta Raf46在本氏烟中的蛋白积累。沉默Ta Raf46显著减弱Pst27791促进条锈菌定殖的能力,暗示Pst27791毒性功能的发挥依赖Ta Raf46。综上表明,Pst27791靶向小麦免疫负向调控因子Ta Raf46,抑制寄主活性氧积累、防御相关基因表达以及MAPK级联途径的激活。3.解析了Pst27791通过抑制醛酮还原酶Ta AKR13D9活性调控小麦免疫的机理本研究进一步通过酵母双杂交技术筛库,在小麦中获得一个新的Pst27791互作靶标Ta AKR13D9。序列分析表明,Ta AKR13D9属于植物醛酮还原酶AKR13D亚家族,编码含有347个氨基酸的蛋白,含有醛酮还原酶保守结构域及催化四联体残基。亚细胞定位和定量分析表明,Ta AKR13D9主要在小麦细胞质和细胞核中分布,并且其转录表达受条锈菌诱导。通过酵母双杂交、免疫共沉淀和GST Pull-down技术进一步证实了Pst27791与Ta AKR13D9存在互作,并明确Ta AKR13D9的还原酶结构域在两者互作中发挥重要作用。体外酶活实验证实Ta AKR13D9具有醛酮还原酶活性,并且其活性可被Pst27791抑制。在小麦中瞬时沉默Ta AKR13D9显著降低小麦对条锈菌的抗性,伴随着活性氧积累和防御相关基因表达被抑制。Ta AKR13D9过表达转基因材料对条锈菌抗病性显著增强,小麦吲哚生物碱含量增多。以上结果表明,Ta AKR13D9在小麦-条锈菌互作中发挥抗病因子功能。综上表明,Pst27791靶向小麦免疫正向调控因子Ta AKR13D9,抑制其还原酶活性促进病菌侵染。综上所述,本研究明确了Pst27791为条锈菌重要致病因子,揭示了其通过稳定感病激酶Ta Raf46的蛋白积累及抑制Ta AKR13D9醛酮还原酶活性的方式调控小麦免疫。本研究为病菌效应子调控植物免疫机理提供了新的见解,并为实现小麦条锈病的可持续控制提供了理论基础。