兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是严重危害兔产业的一种毁灭性传染病,其病原为兔出血症病毒(RHDV)。RHDV衣壳蛋白VP60 P2亚区在病毒吸附入侵宿主细胞过程中起重要作用,以P2为诱饵蛋白研究RHDV的致病机理具有重要意义。兔肝细胞、脾细胞、肾细胞是RHDV的主要靶细胞。本研究通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选兔主要靶细胞中与RHDV P2相互作用的蛋白,为深入研究RHDV的感染过程、揭示RHDV的致病机理提供线索。主要研究内容如下:1.RHDV衣壳蛋白P2诱饵蛋白的表达与鉴定以皖阜株RHDV(FJ794180,RHDVa型)的结构蛋白VP60基因为模板,设计引物克隆P2亚区基因,双酶切后连接到pET-32a(+)表达载体上,构建pET-32a-P2重组载体。经测序正确的重组载体转染大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,超声波破碎菌体,获得高表达量的可溶性重组P2蛋白,western blotting鉴定其特异性。经His TrapTM HP纯化柱纯化获得了较纯的P2蛋白。2.RHDV衣壳蛋白P2亚区与兔主要靶细胞相互作用蛋白的筛选和初步鉴定取2月龄以上的健康非免兔,分离得到原代兔肝、脾、肾细胞,以原核表达的P2蛋白为诱饵蛋白,通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选与P2相互作用的靶细胞蛋白,并对筛选到的蛋白进行GO、KOG、KEGG生物信息学分析。结果显示,(1)兔肝细胞、脾细胞、肾细胞中分别筛选到67个、169个、100个与P2存在潜在相互作用的蛋白,其中肝细胞和脾细胞中同时鉴定到的蛋白有6个,肝细胞和肾细胞中同时鉴定到的蛋白有11个,脾细胞和肾细胞中同时鉴定到的蛋白有17个。值得注意的是,在兔肝细胞和脾细胞中均筛选到LamR蛋白,该蛋白是多种病毒的受体,具有进一步研究的价值。(2)GO注释发现三种靶细胞中与P2有潜在相互作用蛋白的分布规律大体一致。这些蛋白大多定位于细胞质、细胞器和细胞膜;参与细胞过程、代谢过程和单一有机体过程;具有催化活性和结合活性。KOG分类显示,这些蛋白多归类到脂类运输及代谢、一般功能蛋白、翻译后修饰和蛋白转运及分子伴侣、氨基酸转运代谢、能量产生和转化。KEGG通路富集发现参与代谢通路的互作蛋白远高于参与其他通路的互作蛋白。3.LamR与RHDV及其蛋白相互作用的初步鉴定在兔肝细胞和脾细胞中筛选到与P2潜在的互作蛋白——层黏连蛋白受体(LamR)蛋白,该蛋白具有广泛的生理和病理功能,是多种病毒的受体,为进一步确认LamR与P2蛋白的相互作用,我们进行了以下试验:(1)通过激光共聚焦实验验证了肝细胞和脾细胞上LamR与P2蛋白的共定位。(2)原核表达了 LamR蛋白。通过GST pull-down试验验证了 LamR蛋白与P2蛋白的直接结合。免疫荧光实验验证了纯化的GST-LamR蛋白能够阻断P2与原代肝细胞的结合,且该阻断效果与LamR/P2蛋白浓度比有关。(3)将实验回归到天然RHDV病毒粒子上。体外实验,通过激光共聚焦实验证明了 RHDV病毒粒子与LamR在肝细胞上的体外共定位。体内试验,分离RHDV感染24 h后的兔肝细胞,通过激光共聚焦发现在RHDV感染的兔肝细胞内也存在病毒与LamR的共定位。研究证实了 LamR与P2及完整RHDV的相互作用,认为LamR在RHDV感染中发挥了一定作用,但LamR在RHDV入侵及感染过程中的具体作用机制有待进一步研究。本研究为揭示RHDV的感染及致病机理提供了线索。