第一部分HOXA10基因在人苗勒管发育异常中的作用及机制研究背景苗勒管发育异常(mullerian duct abnormalities, MDAs)指女性生殖道先天缺如或严重畸形,可分为原始苗勒管形成异常(先天无子宫无阴道、单角子宫)、双侧苗勒管融合异常(双子宫、双角子宫)及纵隔重吸收异常(完全／不全纵隔子宫)。MDAs在普通人群中发病率约2.4%,在不孕或有不良孕产史的女性中发生率可达5.6%或更高。由于子宫形态及结构异常,MDAs患者可伴有月经异常、妊娠率下降、反复流产、胎儿宫内发育迟滞、胎先露异常、早产等多种妇科及产科问题。绝大多数MDAs患者的致病原因尚不清楚。人工合成雌激素己烯雌酚(DES)暴露是目前唯一已知的环境致畸因素。既往研究者探讨了苗勒管发育过程中的重要基因：WNT基因家族、LHX1、PAX2等与人苗勒管发育异常的相关性,尽管多数研究未能证实基因变异在MDAs发病中的直接作用,但候选基因敲除动物表型及MDAs病例的家族聚集倾向,提示遗传或基因变异是影响苗勒管发育的重要机制。HOX基因属于同源异型盒(homeobox)家族,编码高度保守的转录因子,通过其同源蛋白区段(homeodomain, HD)特异性识别并与目的基因启动子区域结合,在躯体节段性发育中起决定作用,并参与神经系统、中轴骨骼、肢体、胃肠、血液、泌尿生殖道等的发育调节。人类共有39个HOX基因,其中A种簇的腹部B型HOX基因主要表达于女性生殖系统。HOXA10是腹部B型HOX基因的一员。胚胎时期,HOXA10基因在将发育成子宫的苗勒管部位丰富表达,参与子宫节段性发育及分化的调控。Hoxa10基因敲除的雌鼠子宫上部1/4变窄且走形迂曲,转化为输卵管样结构,伴有胚胎黏附异常及蜕膜化缺陷导致的子宫性不孕。胚胎时期暴露于DES,也会影响Hoxa10的表达并导致子宫发育畸形。成年期,HOXA10持续表达于宫体的上皮细胞及基质细胞,是维持雌性生殖道巨大发育弹性的重要机制之一。妊娠前后,HOXA10在类固醇激素的调节下参与围着床期胚胎-内膜的相互作用,介导多种下游基因、细胞因子及生长因子的表达调控,促进内膜细胞的增殖、分泌。因此,HOXA10是MDAs的重要候选基因。目的本研究对192例中国汉族不明原因MDAs女性HOXA10基因的外显子区域进行序列筛查,并对新发的错义突变进行功能预测和体外功能验证,探讨HOXA10基因变异在MDAs发病中的作用及机制。方法募集2009-2011年间就诊于山东大学附属生殖医院的192例中国汉族MDAs女性作为研究对象,以同期就诊的192例子宫发育正常女性作为对照组,应用直接测序技术筛查HOXA10基因编码区。对于新识别的基因变异,应用Clustal W、 SIFT、olyphen-2、Mutation Taster等进行序列保守性分析和功能预测,通过双荧光素酶报告系统检测转录活性、真核荧光载体转染分析蛋白表达和亚细胞定位,探讨新发基因变异的致病作用。结果192例中国汉族MDAs患者HOXA10基因突变筛查共发现4例患者携带2种错义杂合突变：c.394G>A (p.G132R)位于第一外显子LCR区,携带者为一例先天无子宫无阴道患者；p.Tyr57Cys (p.Y57C)突变的携带者分别为一例先天无子宫无阴道、一例纵隔子宫和一例单角子宫患者。Y57C突变此前曾在一例中国汉族双子宫患者中被发现,并证实为致病性突变。G132R在物种间较保守,功能预测显示可能为致病性。体外实验证实G132R突变影响HOXA10对靶基因EMX2、ITGB3启动子的转录调控,但不具有显性负效应。G132R、Y57C突变均不影响HOXA10的蛋白表达及亚细胞定位。结论HOXA10基因突变G132R影响下游基因EMX2、ITGB3的转录表达,HOXA10基因突变是MDAs的潜在致病原因。第二部分HOXA77基因在人苗勒管发育异常中的作用及机制研究背景苗勒管发育异常(MDAs)临床表型高度异质,发病机制尚不清楚。同源盒基因编码高度保守的HOX蛋白,通过其N末端的氨基酸与同源蛋白区段的第三螺旋相互作用与DNA结合,调控基因表达、细胞分化及形态发生。HOXAl1是腹部B型HOX基因的一员,位于HOXA基因簇的尾端,通过与Meisl形成蛋白复合物,参与了苗勒管发育、肾脏形成、肢体发育、血细胞生成等过程。在胚胎时期,HOXAll表达于子宫下段、宫颈及肢芽末端。敲除Hoxa11基因除产生中轴骨骼及肢体骨骼畸形外,还可导致雌鼠及雄鼠不孕/不育。雄鼠不育原因主要在于双侧隐睾所致的严重生精异常。roxa11敲除的雌鼠出生7天内子宫形态与野生鼠没有差别,但14天后,突变鼠基质细胞增生减少、凋亡增加,子宫腺体发育不全且伴有LIF (leukemia inhibitory factor)分泌减少,表现为子宫缺陷所致不孕。Hoxall+/-雌鼠产仔量亦显著减少,提示该基因存在显著的剂量依赖性。近来有学者发现,7号染色体短臂包含HOXAll基因在内的部分区段缺失的患者,表现为类似手-足-生殖器综合征的畸形或严重发育滞后。成年后HOXA11在女性子宫持续表达,参与内膜发育和胚胎着床的调控,是维持月经周期及妊娠过程中子宫巨大发育弹性的重要机制。HOXA11表达异常与着床失败、不孕有关。因此,HOXA11是MDAs的重要候选基因。目的本研究通过筛查270例中国汉族MDAs患者HOXA11基因,识别新发基因变异并进行体外功能验证,探讨HOXA11突变在MDAs发病机制中的作用。方法以2009年1月至2012年12月在山东大学附属生殖医院就诊的270名中国汉族MDAs女性作为研究对象,募集同期就诊的子宫发育正常女性为对照组,应用直接测序法筛查HOXAll编码区。使用Clustal W、Align GVGD、SIFT、 Polyphen-2、Mutation Taster进行生物信息学预测,通过真核荧光载体转染分析蛋白表达和亚细胞定位,双荧光素酶报告系统检测可能的靶基因启动子活性变化,以探讨新识别的HOXAll基因变异的致病作用。结果270例中国汉族MDAs患者HOXA11基因筛查发现1例先天无子宫无阴道女性携带c.260A>G (p.Glu87Gly,p.E87G)新发突变,1例纵隔子宫女性携带c.774G>A同义突变,及SNP rs201081293。E87G位于第一外显子,在各物种间高度保守,功能预测显示可能为致病性。但体外功能实验表明,E87G并不影响HOXAll蛋白表达和亚细胞定位,双荧光素酶活性分析显示HOXA11及E87G突变不影响EMX2、ITGB3的转录活性。结论大样本中国汉族MDAs患者HOXA11基因筛查首次发现E87G突变,初步体外功能实验未发现其对HOXAll蛋白表达、亚细胞定位和转录活性的影响,HOXA11突变不是MDAs的常见致病原因。第三部分HOXA7、HOXA9基因变异与人苗勒管发育异常的相关性研究背景MDAs主要以散发病例为主,提示多基因、多因素致病。HOXA7隶属HOXA基因簇,在胚胎时期的神经外胚层和中胚层、成年女性的输卵管和子宫内膜高表达。在人类初级卵母细胞中HOXA7高表达,伴随卵泡的发育成熟,HOXA7逐渐由细胞核向胞浆转移,其表达水平及定位受雌、孕激素等的调控。过表达Hoxa7的转基因小鼠表现为颜面发育畸形,并在出生后迅速死亡,而Hoxa7敲除小鼠生殖道发育正常且雌、雄鼠均具有生育能力。有研究发现,包括HOXA7基因在内的7p15或7p21.1-p14.3染色体区段缺失女性,其表型类似于手-足-生殖器综合征,或表现为严重发育迟滞。HOXA9基因毗邻HOXA7基因,胚胎时期表达于输卵管原基,通过编码转录因子调控多种组织细胞的增殖与分化,参与多种脊椎动物骨骼、神经、心血管、造血、生殖等系统的形成和发育。成年时期,HOXA9主要在输卵管黏膜上皮高表达,黏膜间质和平滑肌细胞中少量表达,且在月经周期的不同时期表达水平呈周期性变化。Hoxa9基因敲除可致小鼠腰椎节段前移,显著降低小鼠着床率,提示HOXA9参与了胚胎期苗勒管发育、成年期子宫周期性变化及妊娠等多个过程。研究显示在先天无子宫无阴道患者,HOXA9基因的表达及甲基化水平均异常。因此,HOXA7、HOXA9基因被视为MDAs的重要候选基因。目的在192例中国汉族MDAs患者中,筛查HOXA7、HOXA9编码区,探讨HOXA7、HOXA9基因变异与MDAs发病的相关性。方法募集2009-2011年间于山东大学附属生殖医院就诊的192名苗勒管发育异常女性作为研究对象,同期就诊的192名子宫正常女性作为对照组,提取基因组DNA,应用直接测序法筛查HOXA7、HOXA9基因编码区。对于发现的基因变异,比较其在病例组和对照组的频率分布,探讨其与MDAs发病的相关性。结果HOXA7第一外显子发现两个已知SNP：rs2301721和rs2301720,二者频率分布与对照组无显著差异。HOXA9基因测序发现了三个已知SNP,rs35355140位于第一外显子,rs7810502和rsl89587233位于3’UTR区,其中,前两个SNP同时出现于对照组,频率分布无统计学差异；rs189587233仅见于一例双子宫患者中。结论大样本MDAs患者中未发现HOXA7、HOXA9基因致病性突变,HOXA7、HOXA9基因突变不是MDAs的常见致病原因。第四部分单角子宫女性IVF/ICSI-ET妊娠结局特点分析背景MDAs可导致多种临床妇科及产科问题。单角子宫作为MDAs的常见类型之一,其宫腔形态、容积、子宫肌层及血管形成、宫颈等均可能与正常子宫有所不同,从而导致流产和早产率升高。单角子宫是否影响妊娠率、单角子宫女性妊娠并发症及子代健康状况如何等问题,目前尚未见报道。目的本研究分析单角子宫女性IVF/ICSI-ET治疗后的妊娠结局特点,探讨影响妊娠结局的可能因素,为有效的、个体化的临床治疗和生育指导提供依据。方法收集2009年1月至2013年6月在山东大学附属生殖医院就诊的145例单角子宫女性作为病例组,随机选取同期就诊的286名子宫形态正常女性为对照组。两组患者年龄、BMI、不孕类型及IVF/ICSI指征等相互匹配,染色体核型、月经周期及基础内分泌正常,排除子宫肌瘤、自然流产≥3次、PCOS、POF、子宫内膜息肉、宫腔粘连等疾病。收集其临床资料并追踪围产结局。结果单角子宫组平均年龄29.8±3.8岁,BMI22.5±3.3kg/m2,52.4%(76/145)为原发不孕,9.7%(14/145)有1次自然流产史,1.4%伴肾脏异常；对照组平均年龄29.9±3.6岁,BMI22.8±4.0kg/m2,60.1%(172/286)为原发不孕,10.1%(29/286)有1次自然流产史,2.1%(6/286)有2次自然流产史。两组患者基本特征无显著差异。单角子宫和对照组患者IVF/ICSI指征均以输卵管因素为主(67.6%,98/145vs.67.8%,194/286)。基础窦卵泡数、FSH与LH水平、获卵数、优质胚胎数等两组间未见显著差异。28例单角子宫患者有异位妊娠病史(28/145,19.3%),显著高于对照组(30/286,10.5%,p<0.05)。单角子宫组单胚移植率(35/145,24.1%)显著高于对照组(17/286,5.9%,p<0.01),双胚移植率(110/145,75.9%)显著低于对照组(269/286,94.1%,p<0.01)。移植后,单角子宫组临床妊娠率显著低于对照组(62/145,42.8%vs.156/286,54.5%,p<0.05),生化妊娠流产率(21/145,14.5%vs.22/286,7.7%,p<0.05)和早产率显著高于对照组(18/51,35.3%vs.22/126,17.5%,p<0.05),72.2%的早产(13/18)发生于孕34至37周。单角子宫组临床妊娠后流产率(10/62,16.1%)略高于对照组(20/159,17.6%),生化妊娠率(83/145,57.2%vs.178/286,62.2%)和抱婴率(51/145,35.2%vs.126/286,44.1%)稍低于对照组,但无统计学差异。单角子宫组中原发不孕患者76例,对照组172例,单角子宫组临床妊娠率(33/76,43.4%vs.103/172,59.9%,p<0.05)和抱婴率(27/76,35.5%vs.90/172,52.3%,p<0.05)显著低于对照组,早产率显著高于对照组(9/27,33.3%vs.14/90,15.6%,p<0.05)。继发不孕患者中单角子宫69例,对照组114例,两组妊娠结局未见显著性差异。双胚移植患者中单角子宫110例,对照组269例,单角子宫组临床妊娠率(45/110,40.9%vs.151/269,56.1%,p<0.01)和抱婴率(37/110,33.6%vs.123/269,45.7%,p<0.05)显著低于对照组,早产率显著高于对照组(313/37,5.1%vs.22/123,17.9%,p<0.05)。单胚移植患者中单角子宫35例,对照组17例,两组妊娠结局未见明显差异。单角子宫组与对照组患者孕期并发症发生率没有统计学差异(5/145,3.4%vs.8/286,2.8%),最常见的并发症是妊娠期高血压(2/145,1.4%vs.4/286,1.4%)和胎膜早破(2/145,1.4%vs.1/286,0.3%)单角子宫组共分娩51人次,其中12人次(23.5%)为双胎；对照组共分娩126人次,其中44人次(34.9%)为双胎,两组双胎率无显著差异。单角子宫组新生儿平均出生体重2969.8±646.3g,其中低出生体重儿(<2500g)发生率为20.6%(13/63),1500-2500g和<1500g新生儿分别占17.5%(11/63)和3.2%(2/63),与对照组无显著差异(3053.7±595.7g；34/170,20.0%；33/170,19.4%；1/170,0.6%)。单角子宫组与对照组新生儿出生缺陷率无统计学差异(1/63,1.6%vs.5/170,2.9%),单角子宫组发生腹股沟疝1例,对照组分别为先天性心脏病2例,右耳缺如1例,先天性甲状腺功能低下1例和猫叫综合征1例。结论单角子宫女性接受IVF/ICSI-ET治疗后,影响妊娠结局的节点主要发生在早期胚胎着床和近足月时的妊娠维持,其中原发不孕者妊娠结局相对更差,值得格外关注。减少胚胎移植个数、实行单胚移植显著改善单角子宫患者的妊娠结局。单角子宫并不增加孕期并发症和新生儿出生缺陷发生率,其子代总体健康状况良好。第五部分不同类型苗勒管发育异常女性IVF-ET流产特点分析背景双侧苗勒管未发育或发育不全可形成先天无子宫无阴道(MRKH综合征)或始基子宫,导致无法妊娠。其他类型的苗勒管发育异常,包括单角子宫、双角子宫、纵隔子宫、鞍形子宫等均可妊娠,甚至正常分娩。既往研究显示,有复发流产史的纵隔和双角子宫患者孕中期流产率高,而对于无复发流产等不良孕史的MDAs患者,其流产特点及类型分布等并不清楚。目的本部分主要分析不同类型MDAs女性接受IVF-ET后的妊娠结局及流产特点,为临床治疗和生育指导提供依据。方法纳入2009年1月至2012年12月在山东大学附属生殖医院接受辅助生殖治疗的苗勒管发育异常患者277例作为病例组。根据妇科检查、B超、子宫输卵管造影、宫腔镜和/或联合腹腔镜等诊断子宫畸形类型,按照AFS标准进行分类。选取同时期接受体外助孕治疗的子宫正常女性368例为对照组。要求两组年龄、BMI、不孕类型、IVF指征相互匹配。排除内分泌异常、染色体核型异常者。记录研究对象的基础临床信息并追踪第一次超促排卵后的妊娠结局。结果277例MDAs患者平均年龄31.42±4.52岁,BMI22.87±4.05kg/m2,52.7%为原发不孕；对照组368人平均年龄31.06±4.30岁,BMI22.90±5.32kg/m2,51.6%为原发不孕,两组基础临床特征没有显著差异。两组患者IVF-ET指征均以输卵管因素为主(61.4%vs.65.2%)。病例组患者16.2%有自然流产史,显著高于对照组(10.9%,p<0.01)。其中单次自然流产37次(13.4%),复发流产8次(2.9%)。病例组与对照组的基础内分泌、卵巢储备、对超促排卵药物的反应性等方面无显著差异。COH治疗后,病例组HCG日平均内膜厚度为1.02±0.21cm,显著薄于对照组(1.12±017cm,p<0.01)；HCG日E2水平显著高于对照组(p<0.05)。超促排卵治疗后,病例组6个周期(2.2%)妊娠结局失访,取消周期31次(11.2%),接受移植240次(86.6%),妊娠129次,妊娠率53.8%,临床妊娠97次,临床妊娠率40.4%；对照组无一例失访,且第一周期均接受了胚胎移植,妊娠270次,妊娠率73.4%,临床妊娠252次,临床妊娠率68.5%。病例组总流产率17.9%(43次)；对照组流产率15.8%(58次),两组之间无显著差异。病例组生化妊娠流产率13.3%(32次),是对照组的3.236倍(95%可信区间1.664-6.291)。在临床妊娠阶段,病例组流产率4.6%,显著低于对照组(10.9%,p<0.01,校正OR值0.370,95%可信区间[0.176-0.778])。其中,病例组早期流产率显著低于对照组(2.9%vs.9.0%,p<0.01,校正OR值0.294,95%可信区间[0.118-0.733]),晚期流产率高于对照组(2.5%vs.0,p<0.01)。两组患者的异位妊娠率没有显著统计学差异(1.7%vs.1.9%)。按照AFS标准分型,将病例组区分为单角子宫组(n=130)、纵隔子宫组(n=67)、双角子宫组(n=18)、双子宫组(n=9)和鞍形子宫组(n=16),分别分析其流产情况。单角子宫生化妊娠流产率16.2%,显著高于对照组(p<0.01)；临床妊娠后的流产率为3.8%,显著低于对照组(p<0.05)；晚期流产率显著高于对照组(p<0.01),早期流产率和异位妊娠率两组之间没有统计学差异。纵隔子宫患者生化妊娠流产率为13.4%,显著高于对照组(p<0.01),临床妊娠后的早期流产率显著低于对照组(p<0.05)。双子宫及双角子宫患者的总流产率、不同孕期的流产率、异位妊娠率等与对照组均无显著差异。鞍形子宫患者的晚期流产率显著高于对照组(p<0.01)。结论本部分对接受IVF-T治疗后的MDAs患者妊娠结局及流产资料分析显示,MDAs患者主要的妊娠障碍在于早期胚胎着床困难及晚期流产率升高,内膜较薄可能是影响妊娠结局的因素之一。单角子宫增加生化妊娠流产和晚期流产风险,纵隔子宫增加生化妊娠流产率,而鞍形子宫增加晚期流产风险。