论文部分内容阅读
促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)是下丘脑—垂体—肾上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal,HPA)轴的中枢驱动因子。CRH作为重要应激反应分子参与了机体急性、慢性应激反应,并参与了应激反应相关疾病,例如抑郁症等疾病发病机制。已知雌激素核受体介导的信号(nuclear-initiated estrogen signaling,NIES)可以作为核转录因子而刺激CRH基因表达,但是,雌激素膜受体介导的信号(membrane-initiated estrogen signaling,MIES)对CRH表达的效应及其具体作用机制尚未阐明。之前有研究发现,MIES可能通过细胞内磷脂酰肌醇3-羟基激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等通路上调一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性,继而上调一氧化氮(nitric oxide,NO)的生产。NO也是应激反应关键分子,并可能具有刺激CRH释放的效应。因此,我们首先研究MIES是否以及如何通过PI3K、MAPK激酶通路影响NO的产生而影响CRH分泌。在表达雌激素膜受体(membrane estrogen receptor,m ER)包括ERα、ERβ、G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30),以及NOS和CRH等分子的SKN-SH细胞系中,我们采用特异性m ER激活剂,即雌二醇—牛血清白蛋白复合物(estradiol-bovine serum albumin,E2-BSA)激活m ER,在30分钟内观察到NO(P<0.001)和CRH(P=0.019)分泌水平显著升高,NOS1-m RNA表达水平也显著升高(P=0.005)。给予NO的供体,硝普钠二水合物(sodium nitroprusside dehydrat,SNP)也显著上调CRH分泌(P=0.001);而给予NOS抑制剂(7-nitroindazole,7-Ni)则显著抑制CRH分泌(P=0.008)。在SK-N-SH细胞培养基中给予MAPK抑制剂(PD98059,PD)和/或PI3K抑制剂(LY294002,LY),我们发现单独给予LY,或者同时给予PD和LY,可以阻断E2-BSA对NO合成的刺激作用(P<0.001),然而E2-BSA仍能显著刺激CRH分泌水平增加(P<0.001),这意味着存在着不依赖于NO分泌增加的MIES介导的刺激CRH分泌的通路。我们筛选了可能参与MIES通路但是对NO分泌缺乏直接调节效应的细胞内激酶,发现蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可以作为候选分子,并且PKA位于PI3K激酶通路上游。我们继而采用PKA抑制剂H-89dihydrochloride hydrate(H-89)和PKC抑制剂Bisindolylmaleimide IV(BIM)研究了MIES-PKC通路在有或没有NOS抑制剂抑制NO合成的条件下对CRH分泌的影响,并以MIES-PKA(-PI3K)通路作为对照。结果发现,MIES-PKC上调CRH的分泌且不依赖于NO的合成;同时我们验证了MIES-PKA(-PI3K)通路通过促进NO合成而刺激CRH分泌。本项研究的结论是,MIES可以通过细胞内多条激酶途径显著上调CRH的分泌。因此,MIES和NIES都可以通过上调CRH继而上调HPA轴活性而参与应激反应,并可能在应激相关疾病的发病机制中扮演重要角色。未来的研究应揭示MIES和NIES途径分子作为抗抑郁治疗潜在靶点的可能性。