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第一部分食管miRNA及全基因组表达谱筛选分析研究目的筛选食管鳞癌miRNA与全基因组nRNA表达谱,整合分析miRNA及其靶基因在食管鳞癌发生发展中的作用。材料与方法选择8例食管鳞癌组织及其配对的癌旁正常组织用于研究。应用粗切割手段保证用于研究的组织中癌细胞成分大于70%。应用Agilent人类miRNA芯片和Agilent人类全基因组表达谱芯片进行miRNA和mRNA表达谱的检测,利用TargetScan数据库对筛选出的差异niRNA进行靶基因预测,并结合miRNA-mRNA芯片整合分析,获得特异性miRNA的靶基因。根据Gene Ontology. KEGG数据库对miRNA的靶基因进行GO和Pathway分析,筛选出具有显著性可靠性的基因功能分类和信号通路,构建miRNA-Gene-Network和miRNA-GO-Network,定位食管鳞癌中起核心调控作用的miRNA及其靶基因,全面分析其在食管鳞癌发生发展中的作用。研究结果按照差异显著性标准,与癌旁正常组织相比,食管鳞癌组织中有67个miRNA和2992个基因表达差异,从而确定了食管鳞癌miRNA和基因表达谱；生物信息学方法结合miRNA-mRNA芯片整合分析,进一步确定了miRNA的靶基因。基于靶基因的GO和pathway分析显示,受miRNA调控的上调靶基因属206个GO分类,31个pathway分类,受miRNA调控的下调靶基因属88个GO分类,16个pathway分类；上调靶基因的显著性功能主要有血管生成、细胞粘附、有丝分裂细胞周期等；下调靶基因的显著性功能主要有凝血功能、信号转导通路和负调节细胞迁移等,这些功能上调和下调直接或者间接导致了肿瘤的发生发展；上调靶基因参与的显著性信号转导通路主要包括Focal adhesion.Pathways in cancer.TGF-beta signaling pathway.Wnt signaling pathway.p53signaling pathway等；下调靶基因参与的显著性信号转导通路主要包括MAPK signaling pathway、 Tight junction、Arachidonic acid metabolism、Cell adhesion molecules (CAMs)等,这些信号转导通路在一系列重要生物学进程(如细胞运动、细胞增殖、细胞分化、基因的表达调控、细胞存活等)中扮演着至关重要的角色。基于靶基因构建miRNA-gene-Network和miRNA-GO-Network发现：miR-30a-5p、miR-29c-3p、let-7c、miR-126-5p、miR-195-5p、miR-125b-5p、 miR-196b-5p、miR-1等在网络中起核心调控作用,RORA、CDK6、KCNMA1、 TRAF3、IGF1、TGFβ2、VEGFA等是主要被调控的靶基因,信号转导通路、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、血管生成和细胞增殖等是主要被调控的功能,提示这些miRNA和靶基因及其功能在食管鳞癌发生发展中起关键调控作用；结论基于基因芯片筛选获得了食管鳞癌特异性miRNA和mRNA表达谱,通过miRNA-mRNA整合分析,揭示了食管鳞癌中起核心调控作用的miRNA及其靶基因的功能,为进一步研究提供了依据。第二部分食1miRNA及mRNA芯片结果验证研究目的验证部分食管鳞癌组织特异性miRNA和mRNA基因水平的表达,确定芯片结果的可靠性。材料与方法运用实时定量RT-PCR在70例配对的癌及癌旁正常组织中对候选的7个miRNA (miR-21、miR-196b、miR-185、miR-126、miR-195、miR-125b、miR-1)和7个mRNA(Six1、Six4、IGF1、TGFβ2、CDK6、FLNC、VEGFA)进行基因水平验证,分别以小RNA U6和β-actin作为内参,用2-△CT表示肿瘤组织目的基因相对应正常组织原始基因拷贝数的倍数差异,即表示miRNA在两组间表达的相对变化。用SPSS18.0统计软件进行统计分析,实验统计结果以x±sD表示,组间比较采用t检验。研究结果70例扩大样本量的验证表明,RT-qPCR检测的7个miRNA和7个mRNA在食管鳞癌癌组织和癌旁正常组织表达差异显著(P<0.05),表达差异情况与芯片结果一致。结论RT-qPCR检测的7个miRNA和7个mRNA表达与基因芯片结果上调和下调趋势一致,证实了基因芯片检测结果是可靠的,为进一步研究提供基础。第三部分292例食管鳞癌中miRNA原位杂交和Six1、Six4蛋白兔疫组化分析及其与临床预后的关系研究目的探讨7个miRNA (miR-miR-196b、miR-185、miR-126、miR-195.miR-125b.miR-1)和Six1、Six4蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。材料与方法临床病理及预后资料完整的292例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常组织用于制备组织芯片,应用原位杂交、免疫组化方法分别研究7个miNRA和Six1、Six4蛋白在以上组织芯片中的表达水平,分析其表达与临床病理特征及预后之间的关系。研究结果在292例食管鳞癌患者中,miR-21、miR-185、miR-196b在癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,两组差异有统计学意义(P<0.05),提示这3个miRNA可能作为癌基因促进食管鳞癌的发生发展；miR-1、miR-125b、miR-126、miR-195在癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,两组差异有统计学意义(P<0.05),提示这4个miRNA可能作为抑癌基因抑制食管鳞癌的发生发展。x2检验结果显示miR-21与患者远处转移和肿瘤局部浸润相关,有远处转移和肿瘤浸润深度越深miR-21的表达率越高；miR-185与肿瘤分化程度负相关,随着肿瘤分化程度降低miR-185表达率增高；miR-196b与患者年龄及有无淋巴结转移相关,患者年龄较大和有淋巴结转移,则miR-196b的表达率较高；miR-125b与肿瘤局部浸润负相关,肿瘤浸润深度越深miR-125b表达率越低；miR-1与患者淋巴结转移、脉管浸润、远处转移、局部浸润均呈负相关,有淋巴结转移、有脉管浸润、有远处转移、肿瘤浸润深度越深miR-1的表达率越低,且miR-1与患者生存状态也相关,存活组表达率明显高于死亡组；提示这些miRNA可能在食管鳞癌发生发展、浸润转移过程中都发挥着重要作用。Six1、Six4蛋白在癌组织的阳性率分别为72.9%和56.3%,明显高于癌旁正常组织,差异均具有统计学意义(P<0.05)。x2检验结果显示Six1蛋白表达与肿瘤大小、局部浸润及生存状态相关,其在死亡组的阳性率82.3%明显高于生存组的61.9%(P<0.05)。Six4蛋白表达与肿瘤分化程度及肿瘤浸润深度相关,肿瘤分化程度越高、浸润深度越深其阳性率越高。单因素Log-Rank分析发现,性别、TNM分期、miR-1表达、Sixl蛋白表达与食管鳞癌患者的总生存率相关(P<0.05)。miR-1高表达组5年生存率56.9%高于低表达组的42.3%,差异具有统计学意义(P=0.016)。Six1表达阴性组5年生存率51.9%,高于阳性组的43.7%,差异具有统计学意义(P=0.043),其它临床参数与预后未显示统计学差异。多因素COX比例风险模型分析表明TNM分期、miR-1表达及Six1蛋白表达水平是影响食管癌术后患者预后的独立因素(P<0.05)。结论7个miRNA的表达水平与芯片及RT-PCR结果一致,Sixl和Six4蛋白在食管鳞癌组织中高表达,其表达水平与食管鳞癌发生发展及预后密切相关,miR-1低表达及Sixl蛋白高表达是食管鳞癌患者预后不良的因素,可作为食管鳞癌患者预后评估的重要指标。