本论文中的甲烷氧化菌Methylomonas sp.GYJ3是从甘肃玉门油田的土壤中筛选获得，Methylosinus trichosporium IMV3011由俄罗斯科学家友好赠送。本文作者探索了其微生物的生长特性及不同添加剂和培养环境对细胞生长的影响，进行了羟基化酶的分离纯化和表征，测定了甲烷单加氧酶基因序列及其16S rDNA的序列，采用生物信息学方法对基因序列进行了分析。　　 第一章，综述了近年来有关甲烷单加氧酶和甲烷氧化细菌的最新成果，概述包括了甲烷氧化细菌的发现，分布和特性；甲烷单加氧酶的结构表征；甲烷单加氧酶催化反应机理及甲烷单加氧酶分子生物学研究的最新进展，本文作者在此文献基础上，确定了本文作者的研究方向和研究内容。　　 第二章，考察了几种添加剂和培养环境对甲烷氧化细菌生长的影响。本文作者在液体培养基中分别添加了不同量的Cu2+离子，甲醇和离子液体，观察到2μM Cu2+和0.02％甲醇能够促进微生物的生长，而在较高浓度的Cu2+和甲醇将抑制细胞生长。离子液体抑制了细胞的生长，随着离子液浓度的增高，抑制更加明显。光照对细胞生长无任何影响，说明该菌株是非光敏感性的。本文作者尝试了增加反应器的压力，观察细胞生长的状况，发现0.01MPa的压力有利于细胞生长。采用湿重法考察细胞的生长。　　 第三章，应用标准的三步层析方法分离纯化了II型甲烷氧化细菌Methylosinustrichosporium IMV3011中甲烷单加氧酶羟基化酶，并采用电泳、光谱等方法对其进行了表征。本文作者们获得了一个高活性的羟基化酶，它的比活力仅低于Methy -losinus trichosporium OB3b中的羟基化酶。本文作者采用两种方法评价酶的纯度，HPLC法表明酶的纯度在95％以上，SDS-PAGE法显示酶的纯度在97％以上，表明这个酶完全可以满足谱学表征的要求，纯化的酶溶液是无色的，甚至在浓度很高的情况下也是如此。　　 本文作者采用原子吸收光谱法测定了纯酶分子中的Fe、Cu、Zn金属离子，本文作者还观察了羟基化酶的园二色谱和荧光光谱，分析显示羟基化酶荧光发射峰在341.3nm，分子结构是以α螺旋为主。　　 本文作者首次观察了初步提取的羟基化酶稳定性，结果表明酶的稳定性pH值为6.2～7.5(4℃)，酶的稳定性温度为低于35℃(pH7.2)。分别添加不同量的甘油、连二亚硫酸钠、DTT或完全用N2饱和的酶溶液观察酶溶液的稳定性，羟基化酶的相对活性有不同程度的提高，以添加20mM DTT最为明显，可使羟基化酶活性提高18％，尽管酶的活性在一定程度上得到了保护，但结果仍然不能令人满意，说明甲烷单加氧酶对所存在的环境是非常敏感的，而酶活性的长期稳定性仍然是一个需要解决的问题。　　 第四章，本文作者对甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium IMV3011和Methylomonas sp.GYJ3中的16S rDNA和溶解性甲烷单加氧酶基因序列进行了测定，对已完成的序列结果进行了基因信息学分析。利用Ge -nBank数据库中已报道的有关甲烷单加氧酶基因序列信息，设计了PCR扩增引物和基因测序引物，成功的扩增了溶解性甲烷单加氧酶基因和16S rDNA，获得了所期望的结果，并与其它甲烷氧化细菌中相应的组分序列进行比较。　　 通过基因测序，本文作者从Methylosinus trichosporium IMV3011中获得了全长为5319 bp溶解性甲烷单加氧酶基因序列和长度为1290 bp的16S rDNA序列。利用EBI网站的程序对sMMO的六个开放阅读框及其推测的氨基酸序列与其它菌株中相应的序列进行了比较分析，结果显示：与Methylosinus trichosporium OB3b中相应基因的同一性是从99.0％到82.7％；与其它4株甲烷氧化细菌比较，MMOX氨基酸序列的同一性是99.4％到81.8％，相似性是99.8％到89.2％，MMOX组分的序列具有高保守性，特别是在双核铁区域。基于Methylosinus trichosporium IMV3011的16S rDNA序列和MMOX氨基酸序列的生物进化分析表明，菌株IMV3011属于甲基弯菌属，最近似的物种是Methylosinus trichosporium OB3b，进化树被高bootstrap值所支持(重复数是100)，这个结果与DNA和氨基酸序列比较结果相一致。　　 甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3中溶解性甲烷单加氧酶基因和16SrDNA被测序和分析。溶解性甲烷单加氧酶基因的全长为5690bp，部分16S rDNA的序列长度为1280bp。对包括菌株GYJ3的6个甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶各组分进行了比较，结果表明，MMOX组分中氨基酸序列的同一性是从78％到99％，基因序列的同一性是从71％到97％。MMOX氨基酸序列的多序列联配表明MMOX序列具有高度保守性，特别是在双核铁中心区域。基于16S rDNA和MMOX氨基酸的进化分析显示Methylomonas sp.GYJ3与丫蛋白菌相关，属于I型甲烷氧化细菌，最近似的菌株是Methylomonas sp.KSWIII，这与已有的生物化学和形态学研究结果相一致。　　 然而，仅从基因序列比较看，菌株GYJ3与Methylosinus trichosporium.OB3b，Methylocystis sp.W1 14最近似，应属于同一分枝，而这两个菌株属于II型甲烷氧化菌，这个结果似乎是矛盾的，是一个奇特现象。本文作者考虑这可能是由于有关I型甲烷氧化菌基因序列缺乏或所利用的序列数据中存在有错误所致，因为到目前为止，仅有2个来自I型甲烷氧化菌的sMMO基因序列信息被公布，因此，需要更多的来自于纯培养的I型甲烷氧化菌基因序列信息来充实数据库。从生物分类学家Bowman的观点来看，在物种层次上有关甲烷氧化菌的更准确分类标准应是细胞内脂肪酸的鉴定和形态学特征，它能被有效的用于不同甲烷氧化菌的分类学鉴定。　　 这个研究结果进一步在基因水平上证实了I型甲烷氧化细菌也能表达溶解性甲烷单加氧酶，对改变传统概念—sMMO主要表达在II型甲烷氧化菌中和评估含sMMO的Methylomonas在自然界中的重要性有重要意义。据综合分析，我们得出结论：菌株GYJ3是Methylomonas属的一个成员。电镜观察表明，Methylomonassp.GYJ3呈微弯曲的杆状细胞构型，细胞丰满，表面均匀。　　 第五章，描述了溶解性甲烷单加氧酶6个基因的分子克隆与共表达，采用了Novagen公司的最新研究成果～共表达载体，该载体可以携带两个表达单位，由启动子，核糖体结合位点(rbs)，两个多克隆位点，转录T7终止序列，抗性筛选标记等元件构成，共表达载体在细胞中是相互兼容的，在大肠杆菌中可以独立调节两种或多种重组蛋白的共表达。本研究中，选用了三种共表达载体pETDuetTM-1，pRSFDuetTM-1及pCDFDuetTM-1进行分子克隆，成功的获得了含甲烷单加氧酶基因的克隆子。　　 从新鲜培养的Methylomonassp.GYJ3培养液中分离、纯化了做为模板的染色体总DNA，参照已测序的Methylomonas sp.GYJ3中sMMO基因序列，设计合成了七对PCR引物，扩增了sMMO的六个基因组分，根据每个基因片断与共表达载体多克隆位点的限制酶切位点，选择不同的限制酶对基因和载体同时双酶切，将六个基因分别克隆进三个共表达载体中，经过PCR和酶切验证，克隆到三个载体质粒的基因完全正确，成功构建了三个sMMO基因的共表达载体pCDFDuetTM-1-X-orfY，pRSFDuetTM-1-Z-C和pETDuetTM-1-B-Y。并将其中三个sMMO组分MMOB，MMOY和MMOZ在E.coli BL21中进行了探索性的表达研究(IPTG诱导)，表达产物经SDS-PAGE检验，证明均获得了高效表达。　　 总之，本文作者成功的构建了溶解性甲烷单加氧酶基因的共表达质粒，且对其中三个组分在大肠杆菌中进行了高效表达，这个结果将有利于高活性的甲烷氧化菌基因工程菌株的研究，并已成功取得了重要的阶段性成果，具有良好的商用价值和工业应用前景。　　 第六章，对本论文中有关甲烷氧化菌的培养条件，甲烷单加氧酶的分子生物学和理化性质研究结果进行了总结，这些结果将有助于理解sMMO的催化机理，对sMMO的工业应用有重要意义。