胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESCs)具有自我更新能力和高度分化潜能,是细胞治疗以及体外器官再生良好的细胞来源,在多种疾病的治疗方面有很大应用价值。目前已成功建立并获得小鼠、大鼠和人类各种类型的胚胎干细胞。在我国,小鼠和人类干细胞研究取得了多项世界领先水平的研究成果。体外分离建系的小鼠ESCs细胞从发育特征上接近着床前囊胚的ICM细胞,通过嵌合体实验证明ESCs具有贡献胚胎的所有组织,包括生殖嵴,但是不具备胚外外胚层的贡献能力。利用小鼠胚胎干细胞生产人造配子的研究取得突破性进展,但是关于人造胚胎的研究进展相对较慢。因此,本研究利用小鼠八倍体胚胎作为人造胚胎的发育框架,探究小鼠人造胚胎模型。由于ESCs不能形成胎盘,所以本文建立一种具有发育形成胎盘能力的小鼠囊胚来源的新型胚胎干细胞(Advanced pluripotent stem cells,ASCs)。并进一步结合 ASCs 和 8N 胚胎探索建立小鼠人造胚胎发育模型。本研究共分为三个部分,主要的研究结果如下:一、制备小鼠八倍体胚胎发育模型关于以小鼠为代表的哺乳动物多倍体胚胎(4N和8N)发育阻滞的可能机制,虽然从细胞水平和分子水平进行了部分探索,但是还没有形成明确和完整的科学结论。所以我们以小鼠4N和8N的多倍体胚胎作为研究对象,以体内外发育为基础,主要从分子水平探讨其发育阻滞的可能机制。实验结果显示,8N胚胎在体外培养条件下可发育到囊胚阶段,但是不能正常发育到原肠胚。检测发现8N胚胎细胞胚层分化、细胞凋亡、细胞自噬和表观遗传修饰等发生了改变。这些变化可能影响小鼠8N胚胎发育,并成为8N胚胎不能正常发育的可能原因。正由于8N胚胎能形成着床点,而不能发育形成正常的个体,因此可以利用8N胚胎框架进一步探讨小鼠人造胚胎发育模型的研究。二、小鼠新型胚胎干细胞系的诱导及分子鉴定在本实验我们通过两步法诱导建系小鼠囊胚来源的新型胚胎干细胞ASCs。现将小鼠囊胚用化学成分明确的含有激活素A和成纤维细胞生长因子的培养液中,然后再把培养液换成含有激活素A,骨形成蛋白4,CHIR99021和白血病抑制因子的培养液中,从而获得ASCs细胞系。体外培养条件下ASCs细胞具有维持自我更新能力。RNA-Seq和全基因组DNA甲基化测序分析结果显示ASCs与ESCs呈现明显不同的基因表达模式和DNA甲基化水平。从转录组测序结果可以看出,ASCs同时表达多能性基因(Oct4,Sox2和Nanog等)和中胚层分化基因(Eomes,Eras,Tdgf1,Evx1,hand1和Wnt5α等)。而从DNA甲基化水平上ASCs更接近EpiSCs,近50%的甲基化位点与EpiSCs相同,这表明ASCs可稳定的维持基因组高甲基化状态。但是雌性ASCs细胞两条X染色体均处于活化状态,正好与EpiSCs细胞相反。更重要的是,ASCs细胞具有完整的印记基因表达模式,ASCs中印记基因的表达水平显著比ESCs高。因此,ASCs细胞从转录水平,表观遗传修饰和多能性方面存在独特的特征,以上的特征确保ASCs细胞的强大的稳定性和多能性。这些特征足以证明ASCs与ESCs和EpiSCs存在明显不同的自我更新机制。我们获得ASCs细胞对进一步探索构建小鼠人造胚胎提供干细胞来源。三、ASCs多能性鉴定及利用ASCs探索构建人造胚胎模型在胚胎干细胞多能性方面,ASC细胞中cMyc的细胞核定位信号显著高于ESCs细胞,而其他的多能性蛋白定位情况基本与ESCs细胞相一致。ASCs是一种新型的具有独特的自我更新能力的小鼠多能性胚胎干细胞,它的干性正处于ESCs和EpiSCs两种小鼠胚胎干细胞的中间状态。ASCs除了具有维持自我更新能力以外还具备较高的发育潜能。嵌合体实验显示,ASC细胞除了贡献胎儿组织、生殖嵴和卵黄囊以外同时可贡献胎盘迷路滋养层组织,但是不能贡献胎盘巨细胞滋养层部分的能力。而且通过四倍体补偿技术获得高效率的ASCs小鼠,这对胚胎干细胞的研究提供新思路和新的研究工具。同时,我们利用ASCs细胞和8N胚胎的框架相结合,尝试重构小鼠人造胚胎发育模型。我们建立的ASCs细胞和8N重构胚胎模型能在体外培养条件下支持着床前胚胎的发育,但是着床后不能发育形成胎儿组织。所以对研究人造胚胎方面具有一定的应用价值。今后我们将进一步完善ASCs细胞和8N重构胚胎模型的研究。