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双果糖酐III是一种新型的天然功能性甜味剂，具有甜度高、能量值低等特点，并能促进矿物吸收、增进骨骼生长、利于排尿、改善便秘及抑制蛀牙，适用于医药制剂领域及焙烤食品、饮料、糖果等食品领域。目前，生物法双果糖酐III的制备主要是利用微生物表达的菊糖果糖转移酶（IFTase）降解菊糖实现。但野生型菊糖果糖转移酶产量低，而现阶段已经实现的原核大肠杆菌表达又多以胞内形式出现，使IFTase生产的下游操作工艺复杂，极大的制约了该酶的工业化应用。本研究设计诱导型和组成型启动子调控的真核毕赤酵母表达系统，进行菊糖果糖转移酶的胞外分泌表达研究。并利用高密度发酵实现多种培养策略下菊糖果糖转移酶的高效表达，对该酶的工业化应用具有重要意义。本文构建了三种不同启动子调控的包含菊糖果糖转移酶基因（ift）的重组毕赤酵母菌株，研究了重组载体插入毕赤酵母基因组的拷贝数及摇瓶发酵条件对IFTase产量的影响，并将筛选得到的三种P. pastoris菌株利用分批补料策略进行了3L发酵罐的高密度发酵，最终实现了IFTase在毕赤酵母中的高效胞外分泌表达。主要研究内容和结果如下：将ift基因分别插入包含诱导型启动子AOX1（PAOX1）或FLD1（PFLD1）的pPIC9K载体和包含组成型启动子GAP（PGAP）的PGAPZαA载体，通过电转化的方法将包含三种不同启动子的重组载体插入毕赤酵母GS115基因组。并利用抗生素梯度法筛选不同拷贝数的诱导型重组毕赤酵母菌株：GS115-PAOX1-IFTase及GS115-PFLD1-IFTase和组成型重组毕赤酵母菌株：GS115-PGAP-IFTase。其中重组菌株GS115-PAOX1-IFTase及GS115-PGAP-IFTase的IFTase分泌表达能力受目的基因ift插入拷贝数影响较大，且在高拷贝时表现出更高的IFTase活性；GS115-PFLD1-IFTase菌株受拷贝数影响微弱，仅抗1mg/mL G418浓度的菌株表现略高的IFTase活性，表明重组酵母的IFTase表达活性与外源基因插入拷贝数并不总具有正相关性。重组酵母菌株的摇瓶水平研究结果表明，重组酵母GS115-PAOX1-IFTase以甲醇为诱导剂进行的IFTase分泌表达受多种因素的影响。单因素研究最佳发酵条件为：初始生物量OD600=7，装液量10%，培养基pH6.5，每24h补充1.5%发酵体积的甲醇，培养温度和转速分别为30oC和250rpm。菌株诱导96h时后最高酶活达11.92U/mL；重组酵母GS115-PFLD1-IFTase能以甲醇或甲胺盐酸盐作诱导剂，在甲醇-甲胺盐酸盐、甲醇-硫酸铵、甘油-甲胺盐酸盐及葡萄糖-甲胺盐酸盐四种培养基中进行IFTase的分泌表达，且IFTase活性极大的受到菌体密度的影响。与大多文献报道不同，在以甲胺盐酸盐作诱导剂时，甘油和葡萄糖也可以成为PFLD1调控酵母表达IFTase的有效碳源，但初始浓度都需严格控制在较低浓度范围内（分别为：0.5%-1.5%和1%-1.5%），过高浓度时将由于菌体的过度生长而严重影响IFTase的产量。而过低的菌体量则是导致重组菌在甲醇-甲胺盐酸盐双诱导剂作用下IFTase活性偏低的原因，辅助氮源酵母膏/胰蛋白胨（Y/P）的添加可以有效提高联合诱导条件下重组菌株的生物量及IFTase活性；PGAP调控的重组酵母GS115-PGAP-IFTase无需诱导物存在即可在甘油或葡萄糖为碳源的培养基中实现IFTase的分泌表达。菌体的过度生长是该组成型重组酵母IFTase低表达量的主要原因，且摇瓶水平甘油和葡萄糖初始浓度应分别控制在2%-4%和4%-5%范围。将各重组菌利用生物盐培养基在3L发酵罐中进行分批补料策略的高密度发酵，使IFTase实现了高效的胞外分泌表达。以甲醇为诱导剂的PAOX1调控的酵母重组菌株具有最强IFTase胞外表达能力，最高IFTase活性可达105.4U/mL，分别是IFTase在野生菌和大肠杆菌中表达的5.4和1.3倍；PFLD1调控的重组酵母高密度发酵条件下菌体量获得了极大的提高，在甲醇-甲胺盐酸盐双诱导剂作用下具有比单诱导剂更强的IFTase表达能力，且胞外IFTase活性达到62.72U/mL，是野生酶的3.2倍。而甘油和葡萄糖碳源条件下菌株的IFTase活性与摇瓶水平相比也分别提高了4.3和7.2倍；利用阶段调控及补料策略，GS115-PGAP-IFTase重组酵母的IFTase活性分别是摇瓶条件的7.7和8.3倍，是野生酶的1.7和2.2倍，也使IFTase的胞外表达实现了较大的提高。诱导型菌株的IFTase发酵液可以经过硫酸铵沉淀及DEAE离子交换层析进行简单纯化，组成型菌株发酵液经过Ni柱纯化获得单一条带的IFTase蛋白。重组IFTase性质研究显示其最适温度和pH分别为60oC和6.5，稳定性也与野生酶相差不大，表明毕赤酵母表达系统可以成为IFTase胞外高效分泌表达的优良宿主。