论文部分内容阅读
海洋双RNA病毒（MABV）能够引起海洋生物尤其是鱼贝类生物的腹水病等，该病的暴发给海产养殖业带来巨大的经济损失。MABV隶属于双RNA病毒科水生生物双RNA病毒属，传染性胰腺坏死病毒（IPNV）是该属的代表种。VP2和VP3为MABV病毒的主要结构蛋白，常用于该病毒的诊断和疫苗设计。鲤春病毒血症病毒（SVCV）引起的鲤春病毒血症（SVC）是一种急性、出血性、高致死性的传染性疾病，它的流行给各国特别是欧洲的水产养殖业带来了巨大的经济损失。近年来，该病已扩展到美洲和亚洲，成为鱼类重要的传染性疾病。SVCV隶属于弹状病毒科水泡性病毒属，G蛋白是其囊膜蛋白，M蛋白是其基质蛋白，二者都是病毒的主要结构蛋白，常用于该病毒的诊断和疫苗设计。本研究利用家蚕杆状病毒表达系统实现了MABV主要结构蛋白基因VP2e和VP3以及SVCV囊膜蛋白基因G和基质蛋白基因M在家蚕细胞中的表达。首先，以PCR扩增获得了VP2e、VP3及G蛋白、M蛋白基因；其次，与载体PMD19-T连接，验证正确后，再将其分别克隆到载体pFastBac HTB和pFastBacI上，获得了转移质粒pHTB-VP2e、pHTB-VP3以及pF1-G和pF1-M；然后，将转移质粒转化具家蚕杆状病毒（BmNPV）Bacmid的E.coLi BmDH10Bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，PCR验证后，获得了重组Bacmid His-VP2e/rBm、His-VP3/rBm以及G/rBm和M/rBm；最后，提取重组Bacmid DNA，利用脂质体转染家蚕Bm5细胞，获得了重组杆状病毒His-VP2e/vBm、His-VP3/vBm及G/vBm和M/vBm。收集感染病毒细胞，经SDS-PAGE、Western blot分析，表明，VP2e、VP3及G、M基因在家蚕细胞内成功进行了表达。这为进一步研究MABV VP2e、VP3和SVCV G蛋白、M蛋白的功能，开发快速诊断试剂盒及利用这些表达蛋白进行MABV和SVCV的疫苗研究奠定了研究基础。通过对SVCV G蛋白的生物信息学分析，我们发现其具有信号肽、跨膜域等，我们构建了表达SVCV G蛋白不同结构域片段的重组病毒Bacmid，为阐明G蛋白的结构域打下了研究基础。首先，将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因克隆至载体pcDNA3.1，构建载体pcDNA3.1-EGFP。然后，分别克隆G蛋白基因的不同片段至pcDNA3.1-EGFP，构建载体pcDNA3.1-EGFP-G、pcDNA3.1-EGFP-GA、pcDNA3.1-EGFP-GB、pcDNA3.1-EGFP-G(1-466)。再分别将EGFP-G、EGFP-GA、EGFP-GB、EGFP-G(1-466)等基因片段克隆至转移载体pFastBac I，构建转移质粒pF1-EGFP-G、 pF1-EGFP-GA、 pF1-EGFP-GB和pF1-EGFP-G(1-466)；提取转移质粒DNA，转化E.coLi BmDH10Bac感受态细胞，获得了重组Bacmid EGFP-G/rBm、 EGFP-GA/rBm、 EGFP-GB/rBm和EGFP-G(1-466)/rBm；将进一步通过在家蚕细胞中融合表达这些基因片段及EGFP，明确SVCV G蛋白的信号肽、跨膜域等蛋白的结构域。