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背景及目的宫颈癌是常见的妇科肿瘤,其发病率在发达国家仅次于乳腺癌、子宫内膜癌,在发展中国家则居首位。宫颈癌的发生与很多因素相关,如早婚、早育、吸烟、长期服用避孕药、免疫低下、病毒感染等,其中最主要的是高危型人乳头瘤病毒的慢性持续感染。目前,宫颈癌治疗主要以手术切除为主,但早期宫颈癌无明显症状和体征,易造成漏诊或误诊,待发现时已到中晚期,丧失最佳手术时机。放疗、化疗毒性极大,受到剂量依赖性和抗药性的影响,效果不理想,病人的五年生存率仍然很低。因此,寻找一种早期、安全、高特异性的筛查方法是目前面临的关键问题之一。噬菌体展示技术将外源多肽的表型与基因型紧密联系在一起,使得人们在无需预先知道受体分子结构的情况下,就可获得与各种靶分子特异性结合的配体短肽,是一种筛选特异性多肽的高通量、简便、经济的技术。多肽分子质量小、免疫原性低、亲和力高、组织穿透性强、易合成等,因此,有望与适当的荧光标记物、纳米颗粒、脂质体或抗肿瘤药物偶联用于肿瘤的早期影像诊断、靶向治疗、病程监测及疗效考核,对于目前癌症防治所面临问题的解决具有重要的实际意义。早发现、早诊断、早治疗是提高宫颈癌患者存活率的关键。本实验以期获得与宫颈癌细胞特异性结合的多肽基序,为下一步研发宫颈癌早期影像诊断和靶向治疗探针奠定基础。方法本实验以人胚肾HEK293细胞为阴性吸附细胞,宫颈癌SiHa细胞为靶细胞,利用噬菌体十二肽库进行4轮全细胞消减筛选。第4轮筛选得到的噬菌体库不扩增,直接滴定,从LB/IPTG/Xgal平板上随机挑选57个克隆,ELISA初步鉴定阳性克隆,提取阳性克隆DNA测序,推导相应多肽序列,获得若干consensus sequences,软件分析各序列的同源性、氨基酸组成及特征、疏水性等。最后以细胞免疫荧光鉴定阳性噬菌体克隆的结合特异性、敏感性,确定最佳克隆。结果1.经过4轮“吸附—洗脱—富集”消减筛选,与宫颈癌SiHa细胞特异性结合的噬菌体克隆回收量增加21倍;2.ELISA鉴定结果发现,随机挑选的57个克隆中有36个与SiHa细胞亲和力较高,初步确定为阳性克隆,阳性率为63.16%,其中S7号克隆亲和力最强,但其靶向性有待进一步研究;3.阳性噬菌体克隆测序,得到6条共有序列,分别为KNLXXXXXXPLV、ETLXXXXXXIPW、QQLXXXXXXTPY、VTAXXXXXXXTPL、SLSXXXXXXTTS、TITXXXXXXSRK;4.6条序列之间存在不同程度的重复,其中CSP2和CSP3的相似度最高,达50.0%;5.BLAST检索显示,6条多肽与某些细胞表面受体、转录因子、免疫球蛋白、转运蛋白等同源性较高;6.对6条多肽的组成分析发现,总共出现17种氨基酸,其中丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸出现的频率较高,分别为16.67%、15.28%和13.89%;7.蛋白等电点检测结果显示,CSP1、CSP5和CSP6为碱性多肽,而CSP2、CSP3及CSP4为酸性多肽;8.对6条多肽的疏水性分析发现,除了 CSP1为疏水性多肽,其余均为亲水性多肽,CSP2的亲水性最弱,CSP6的亲水性最强;9.S7克隆与SiHa细胞具有较好特异性及敏感性,确定为最佳阳性克隆,有进一步研究开发的必要。结论1.利用噬菌体展示技术、ELISA、细胞免疫荧光等获得了与人宫颈癌细胞SiHa特异性结合的噬菌体阳性克隆,其中S7克隆(QQLXXXXXXTPY)亲和力最高,特异性、敏感性最强,确定为最佳克隆/肽序;2.该肽有望与纳米颗粒、荧光标记物、脂质体或抗肿瘤药物偶联,用于宫颈癌的早期分子影像诊断、病程监测、靶向治疗及疗效考核等。