论文部分内容阅读
细菌非编码sRNA是一类长度范围在50-500bp之间的核酸分子,对靶基因的表达调控主要是与靶基因的mRNA序列通过碱基互补配对的方式来完成的。多数sRNA是由位于编码蛋白质的基因的5’和3’端之间的基因间区域或非翻译区编码。sRNA是生物体内重要的调控因子,参与生物体内的很多活动。为筛选出与稻黄单胞菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae PX099A中与致病性相关的非编码小RNA,将PX099A分别在普通生长培养基PSA和hrp基因簇诱导培养基XOM2中进行培养,分别提取菌体总RNA,送公司进行高通量测序。对高通量测序结果进行分析,构建水稻白叶枯病菌Xoo PX099A sRNA文库。根据编码区域的不同及在基因组中的位置信息将测序得到的sRNA分为顺式(cis-)和反式(trans-)两类,其中cis-sRNA有337个,trans-sRNA有264个;对比sRNA在两种培养基中的表达水平,筛选出差异性表达比较明显的10个sRNA,通过qRT-PCR对高通量测序结果进行实验验证,得到的结果基本上一致;通过TargetRNA软件预测表达差异明显的sRNA的靶标基因,初步了解其功能,如trans3747可能调控细胞的分裂和膜蛋白的形成。利用同源臂双交换的方法敲除PX099A中的sRNA基因并进行基因回补,获得PX099A ΔsNA缺失菌株和C-sRNA回补菌株。通过测定sRNA缺失突变体的生长速率、对寄主水稻的致病性以及在非寄主烟草上的过敏反应来研究sRNA的病理学功能。结果表明:与野生型相比,在PSA培养液中sRNA缺失突变体生长速率减缓,不同的sRNA缺失后对PX099A菌株的影响不同;不同的sRNA缺失突变体在水稻日本晴上的致病性也不同,其中sRNAtrans217和trans3287缺失后,对水稻无致病性,表型比较明显,说明trans217和trans3287对水稻的致病性具有调控作用,而trans191缺失后与野生型的表型基本上一致,说明trans191对水稻的致病性无影响;不同的sRNA缺失突变体侵染水稻后叶片的含菌量与野生型PX099A侵染叶片的含菌量也不相同;sRNA回补后可恢复PX099A对水稻的致病性和其自身的生长速率;sRNA缺失突变体引起的烟草过敏反应也不相同,其中trans217和trans3287缺失突变体基本不能引起过敏反应,而trans191缺失突变体与野生型PX099A引起的过敏反应几乎无差别;sRNA缺失影响hrp基因簇相关基因hrpG和hrpX的表达量。Harpin蛋白是由Ⅲ型分泌通道分泌的并受hrp基因调控的一类蛋白质,而HpalXoo是由Xoo产生的harpins蛋白。研究以HpalXoo为诱饵筛选拟南芥cDNA文库,初步筛选到6个阳性互作因子,包括植物水通道蛋白PIP1;4。通过双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)和荧光染料的观察证实了 Hpa1Xoo与PIP1;4在细胞膜上发生直接互作,而N端缺失53个氨基酸的Hpa1Xoo蛋白(ANT)则不能与PIP1;4发生互作。Hpa1-AtPIP1;4的互作能增加叶片光合速率,促进植物生长。在拟南芥中Hpa1Xoo促进植物增长的过程与光合生理相关,并能够增强叶肉细胞导度(gm)和净光合速率(AN),这表明Hpa1与PIPs的互作可能促进C02的运输。