在中国癌症病例中肺癌高居榜首,同时近年来肺癌的发病率和死亡率一直呈现显著上升趋势,其中非小细胞肺癌Nonsmall-cell Lung Cancer大约占80%-85%左右。肺癌给患者带来了极大的痛苦和伤害,因此寻找安全可靠的药物已成为一个迫切的问题。顺铂在临床应用上应用较广,但因其具有明显的副作用及较高的耐药性,迫使急需探寻其他的药物作为其伴侣抗癌剂。已有研究表明聚醚类离子载体抗生素联合各类药物的应用表现出了克服肿瘤细胞耐药的优越性。联合用药旨在寻找可降低毒副作用,提高抗肿瘤效果的药物组合,为提高癌症患者的幸福感,规避伤痛做出巨大贡献。本实验中的供试药物为顺铂和马杜霉素,研究对象为人肺癌A549细胞,探究顺铂与马杜霉素联合应用时的抗肿瘤作用及初步作用机制。运用MTT法、台盼蓝拒染实验探究顺铂与马杜霉素联合应用对细胞增殖作用的影响;吉姆萨染色、吖啶橙染色、Hoechst33258染色及扫描电镜分析了顺铂与马杜霉素联合应用造成的细胞及细胞核形态的变化、细胞表面结构变化;使用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测顺铂与马杜霉素联合应用对细胞迁移能力的作用;采用Annexin V-FITC/PI双染法运用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜检测顺铂与马杜霉素联合应用时细胞凋亡情况。为了进一步探究药物发挥作用的机制,应用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜检测细胞活性氧水平变化;Caspase酶活检测、外加Caspase酶抑制剂检测细胞存活率研究Caspase家族参与情况及对细胞凋亡的作用;最后,利用蛋白免疫印迹实验,检测细胞凋亡通路中关联蛋白的表达情况以及自噬关联基因的蛋白水平。实验结果表明,顺铂、马杜霉素对A549细胞的增殖具有抑制作用且呈剂量依赖性,两药进行联合应用时呈现出协同或相加作用,同时顺铂、马杜霉素以及两药联合处理都能显著降低细胞的迁移能力,其中联合应用时效果最为突出,且呈现时间依赖性。细胞形态学检测可以观察到药物处理后细胞形态趋于圆形且出现凋亡小体;顺铂、马杜霉素单药处理后A549细胞凋亡率都出现不同程度的升高,两药联合处理后细胞凋亡率由1.85%上升至42.9%,并且细胞内活性氧水平也显著提高;Caspase酶活检测结果显示细胞中Caspase-3/4/8/9酶的活性均有明显提升,但Caspase-6酶的活性并无改变,由此外加Caspase酶抑制剂进行反向验证,联合药物处理组在加入Caspase-3/4/8/9酶抑制剂后细胞的存活率都出现了显著上升;蛋白免疫印迹检测观察到促凋亡蛋白Bad、Bax的表达增加,抑凋亡蛋白XIAP表达减少,线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt C的表达量增加,PARP作为Caspase-3的底物被切割产生切割条带,PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、P-AKT、AKT、P-ERK的表达量减少,总ERK的表达量不变;自噬相关蛋白ATG5、ATG7表达量提高,并且LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值明显提高。研究结论:1.顺铂与马杜霉素均能抑制A549细胞增殖,且呈现剂量依赖性,一定浓度的两药联合具有协同或者相加作用,具有较显著减毒增效作用。2.顺铂联合马杜霉素能显著降低A549细胞迁移能力。3.顺铂联合马杜霉素可能是通过介导ROS水平诱导PI3K/AKT-ERK1/2信号通路加剧A549细胞凋亡。4.顺铂联合马杜霉素依赖Caspase家族的级联反应加剧A549细胞凋亡的发生,且与内源性线粒体途径及外源性途径有关。