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从采集的朽木和纸浆样品中通过选择培养基平板初筛,分离获得了100余株菌。从中筛选得到五株产透明圈较明显的菌株。经初步发酵后有两株产纤维素酶活较高的菌株,编号分别为AY1和TY2。对其形态和188 rDNA特征序列分析鉴定AY1为曲霉属(Aspergillus sp.),TY2为木霉属(Trichoderma sp.)。
通过对两株菌发酵条件进行研究,结果表明:AY1的最佳发酵条件为:1%CMC-Na+4%麸皮+1%葡萄糖为碳源,0.5%尿素为氮源,150 ml三角瓶中装瓶量40ml,起始pH为4.0,接种量为6%,温度28℃,200 rpm的转速震荡培养6天,其CMCase和FPase活力分别为107.8 U/ml和26.6 U/ml;TY2菌株的最佳产酶条件为:1%滤纸+2%麸皮+0.5%葡萄糖为碳源,0.5%蛋白胨为氮源,150mL三角瓶装瓶量40mL,起始pH为5.0,接种量为6%,温度28℃,200 rpm的转速震荡培养5天,其CMCase和FPase活力分别达412.5 U/mL和100.3 U/mL;以甘蔗渣(来源于韶关大宝山矿山污染土壤所种植甘蔗)中铬离子、铅离子、铜离子和锌离子重金属含量为参照标准,研究了两株菌的金属耐受性,结果发现分别在AY1和TY2菌株发酵液中添加含5倍的上述重金属含量时,所产纤维素酶仍能够保持较高的活力,随着以上重金属盐的含量升高,两株菌所产纤维素酶活力下降,当含量达到50倍时,活力降低最为明显。
对两株菌发酵粗酶液的内切β-葡聚糖苷酶酶学性质进行研究,发现AY1和TY2的最适pH为4.6,最适温度为60℃,在70℃保温1h后,TY2菌株相对残留酶活仍有75.02%,AY1菌株相对残留酶活为23.09%;两株菌pH值在3.0~5.0之间时,酶活比较稳定。
经(NH4)2SO4分级盐析,Macro1-Prep DEAE弱阴离子交换柱层析和Bio-Gel P-60凝胶过滤后,分离纯化出TY2菌株内切β-葡聚糖苷酶。经纯化,酶活力回收率为9.26%,该酶纯化倍数为50.21倍。经SDS-PAGE电泳,只显示单一的蛋白条带,且为单亚基蛋白,分子量约为59.9 KDa,纯酶的Km为13.026 mg/mL,TY2菌株纯酶的内切β-葡聚糖苷酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.6,在50℃以下,pH 3.0~5.0之间,酶活性稳定,且在80℃仍具有降解CMC-Na的效果,说明该菌株所产纤维素酶具有较宽的温度适应范围。同时研究发现铜离子、锌离子、钾离子和钠离子对TY2菌株纯酶内切β-葡聚糖苷酶的酶活有促进作用,而汞离子有明显的抑制作用。