【摘 要】
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目的:坐骨神经损伤（sciatic nerve injury,SNI）是指由交通事故,工伤或者手术引起的,以神经支配区域的肌肉瘫痪和感觉丧失为主要表现的一种周围神经损伤疾病。目前该病主要通过手术治疗改善,但由于坐骨神经解剖非常复杂,故多数预后较差。作为一种严重的神经系统疾病,坐骨神经损伤不仅极大的影响了患者的生活质量,也给其带来了巨大的经济负担。因此,在现有的研究基础上,进一步探究坐骨神经损伤相关
【基金项目】
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辽宁省自然科学基金项目:LncRNA Mcoln2-205/miR-181信号通路对周围神经再生的影响及其机制研究（No.2019-MS-394）；
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目的:坐骨神经损伤（sciatic nerve injury,SNI）是指由交通事故,工伤或者手术引起的,以神经支配区域的肌肉瘫痪和感觉丧失为主要表现的一种周围神经损伤疾病。目前该病主要通过手术治疗改善,但由于坐骨神经解剖非常复杂,故多数预后较差。作为一种严重的神经系统疾病,坐骨神经损伤不仅极大的影响了患者的生活质量,也给其带来了巨大的经济负担。因此,在现有的研究基础上,进一步探究坐骨神经损伤相关的病理机制仍具有重要的意义。本研究旨在阐明小鼠坐骨神经损伤后背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）中长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）的表达变化及关键lncRNA的功能,为坐骨神经损伤提供新的潜在治疗靶点。研究方法:本研究采用8-12周龄的雌性C57BL/6野生型小鼠制备坐骨神经损伤模型,在损伤后3天提取出损伤组和假损伤组（对照组）腰4和腰5（L4-5）DRG的总RNA。之后应用高通量测序的方法检测损伤后信使RNA（messenger RNA,mRNA）和lncRNA的表达变化,并用实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）对测序的差异表达结果进行验证,筛选出关键的lncRNA。针对筛选出来的lncRNA,应用电转染的方法及小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）调控其表达,并应用免疫荧光染色技术观察并分析lncRNA表达变化对神经元轴突生长的影响。此外,通过生物信息学方法对变化的mRNA和lncRNA进行分析,利用GO和KEGG分析筛选出与神经元轴突再生相关的关键差异基因,之后再通过Targetscan和miRDB在线软件预测潜在的靶向微小RNA（microRNA,miRNA）。最后在cytoscape软件中构建lncRNAmicroRNA-mRNA的网络关系图,预测其潜在的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）作用机制。结果:高通量测序结果显示小鼠坐骨神经损伤后3天DRG中的lncRNA表达情况发生改变,损伤组一共有395个lncRNA发生表达量的改变,其中已经被Gencode数据库验证过的lncRNA有97个。对表达量变化最明显的前20个lncRNA进行qRT-PCR验证,发现损伤组中lncRNA Gm43154-204,Gm35330-205,Gm35154-201,Sox5os3-201,Gm49698-201,Gm31831-202表达明显上调,与高通量测序结果一致。挑选表达量变化最大的lncRNA Gm31831-202进行进一步的功能实验研究,发现用siRNA抑制其表达后能够促进体外培养的DRG神经元轴突再生,说明lncRNA Gm31831-202有抑制外周神经元轴突再生的作用。之后在lncRNA和mRNA测序结果的基础上,利用生物信息学方法进行富集分析筛选lncRNA的潜在靶基因,共筛选出与轴突再生相关的基因61个;然后对差异基因进行功能富集分析筛选出与轴突再生相关的基因,统计筛选出的相关基因共449个;利用Targetscan等软件对靶向的miRNA进行预测,挑选出可能结合的miRNA共21个。整理lncRNA与miRNA,miRNA与mRNA之间的作用关系,用cytoscape软件画出预测的ceRNA网络图,从中挑选出5条最有可能的ceRNA网络:（1）Zfhx2os-202/mmu-miR-760-3p/Slc1a2;（2）Gm12367-202/mmu-miR-491-5p/Slc1a2;（3）Gm42756-201/mmu-miR-670-3p/Slc1a2;（4）Zfhx2os-202/mmumiR-185-5p/Slc1a2。（5）Gm10575-204/mmu-miR-129-5p/Glul。结论:本研究利用高通量测序技术,筛选出了小鼠坐骨神经损伤后表达量改变的一系列lncRNA。并且通过功能试验,证明了lncRNA Gm31831-202对DRG神经元轴突再生具有抑制作用。同时利用生物信息学方法,对坐骨神经损伤后神经再生相关的竞争性内源RNA进行了预测。我们的研究揭示了一个全新的lncRNA对神经再生的影响,同时为周围神经再生的机制研究做出了初步的预测,从而为周围神经损伤再生提供了新的视角和潜在治疗靶点。
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