我国养殖行业的养殖规模不断壮大,集约化水平不断提高,但养殖业的疾病情况却呈现越来越复杂的态势,多种病原混合感染,原有病原不断变异和新病原不断出现等,都严重威胁我国养殖行业的发展。目前病原的检测方法主要包括单重PCR、多重PCR、定量PCR、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和胶体金试纸条等,上述方法都是建立在已知病原核酸序列的前提下才能进行,且单次试验检测病原数量有限,缺乏应对病毒变异及发现新病原的能力,无法对当今复杂的疾病情况做出较为全面准确的诊断。为了应对当前养猪业日益复杂的疾病问题,提高病原检测能力,丰富检测内容,为复杂病例提供防治思路,本研究将宏基因组学与高通量测序技术相结合,建立了检测猪源病毒的检测方法。研究内容如下:(1)基于宏基因组学与高通量测序技术建立检测猪源病毒的方法本研究以DNA病毒(猪圆环病毒2型(Porcine circovirus virus type 2,PCV2)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)),RNA病毒(猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))的混合病毒液为阳性样本,用于检测方法的建立。提取阳性样品的DNA和RNA。DNA经多重置换反应提高核酸浓度;RNA反转录为单链c DNA后利用Klenow fragment聚合酶合成c DNA第二条链并补齐末端。多重置换反应产物与双链c DNA使用随机引物进行序列非依赖性单引物扩增。将扩增的产物进行核酸纯化并浓缩。取浓缩产物500 ng进行末端修复,添加A尾,连接接头和PCR富集,从而完成文库构建。经高通量测序和生物信息学分析得出检测结果。文库质检结果显示,构建的文库浓度为37.4 ng/μL,文库峰型单一,无杂峰,无接头和引物二聚体,提示文库质量良好,满足测序需求。经高通量测序共获得了2.90 G clean data,由碱基质量分布图可知,测序碱基正确率在99.90%以上,提示测序质量良好。经生物信息学分析,阳性样品中均检测到预先加入的PCV2、PRV、PEDV和PRRSV,其中PCV2、PRV、PEDV和PRRSV的占比分别为65%、2%、12%和13%,证明该方法成功建立。(2)猪繁殖障碍病例和猪腹泻病例的病原学调查利用该方法检测10例猪繁殖障碍病例,经高通量测序及生物信息学分析,共获得2 914 036条reads,可分为与无脊椎动物相关的杆状病毒科;与细菌相关的肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科;与脊椎动物相关的细小病毒科、圆环病毒科、黄病毒科和星状病毒科等10科。其中1号病例检测到的主要病毒为PRV;2号病例检测到的主要病毒为猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)、猪博卡病毒5型(PBo V5)和日本乙型脑炎病毒(JEV);3号病例检测到的主要病毒为猪细小病毒2型、猪细小病毒6型、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和指环病毒(TTSu V);4号病例检测到的主要病毒为PPV2、PPV3、PPV6、PCV1和PCV2;5号病例检测到的主要病毒为JEV、经典猪瘟病毒(CSFV)、PEDV和猪PRV;6号病例检测到的主要病毒为TTSu V 1b和TTSu V1a;7号病例检测到的主要病毒为JEV;8号病例检测到的主要病毒为PCV1、PCV2、PEDV、PRV、JEV和PRRSV;9号病例检测到的主要病毒为PPV2、PPV3、PPV6、PCV1、PCV2、JEV和TTSu V;10号病例检测到的主要病毒为PBo V5和猪星状病毒2型(PAst V2)。其中,JEV检出率为50%(5/10);PPV2、PPV6、PCV2、PCV1、TTSu V检出率均为40%(4/10);PPV3、PRV检出率均为30%(3/10);PBo V5、PEDV检出率均为20%(2/10);CSFV、PRRSV、PAst V检出率均为10%(1/10)。利用该方法检测4例猪腹泻病例,经生物信息学分析,共获得1 958 451条病毒reads,其中注释到与无脊椎动物相关的病毒主要包括:杆状病毒科;与细菌相关的病毒主要包括:肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科和短尾噬菌体科;与脊椎动物相关的病毒主要包括:布尼亚病毒科、细小病毒科、圆环病毒科、冠状病毒科、指环病毒科和黄病毒科。其中1号病例检测到的主要病毒为PPV3、PPV6和TTSu V1b;2号病例检测到的主要病毒为PEDV、PPV3和PPV6;3号病例检测到的主要病毒为PCV2、PEDV、PPV2、PPV3和PPV6;4号病例检测到的主要病毒为PCV3和PEDV。其中PPV3、PPV6、PEDV检出率均为75%(3/4);PPV3、PCV2、PCV3、JEV、TTSu V检出率均为25%(1/4)。通过序列拼接得到PCV2、PPV2、PPV3、PPV6和PAst V2全基因组序列。遗传进化分析结果显示5种病毒的核酸序列与其相应病毒的核酸序列同源性较高,且存在氨基酸位点改变。(3)猪细小病毒2、3和6基因型多重PCR方法建立与应用通过前期的研究,发现PPV不论是在猪繁殖障碍病例中还是在猪腹泻病例中均有检出,且存在多型PPV混合感染的情况。目前尚无能同时检测PPV2、PPV3和PPV6的检测方法。为快速检测3种PPV,有必要建立一种检测速度快,特异性好,敏感度高的检测方法,为进一步了解PPV在我国猪场的流行情况提供技术支持。本研究针对PPV2、PPV3和PPV6的部分NS基因,分别设计3对特异性引物,分别扩增PPV2、PPV3和PPV6部分NS基因。通过对引物终浓度、退火温度和反应循环数等条件进行优化,建立多重PCR方法。通过特异性试验和敏感性试验等检验该方法的特异性和敏感性。试验结果证明,本方法敏感性良好,对PPV2、PPV3和PPV6的标准质粒最低检测值分别为4.32×10~3copies/μL、9.62×10~3copies/μL和4.25×10~3copies/μL。该方法特异性良好,对PCV2、PEDV、PRRSV、PRV、JEV、副猪嗜血杆(Haemophilus parasuis,HPS)和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)等病原的核酸均无扩增。检测25份临床样品,PPV2、PPV3和PPV6检出率分别为12.00%(3/25)、16.00%(4/25)和16.00%(4/25),与单重PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床样品检测。进一步检测来自湖北等地40个猪场共计250份猪繁殖障碍样品,结果显示PPV2、PPV3和PPV6的检出率分别为8.40%、11.60%和9.60%,其中PPV2与PPV3、PPV6的混合感染率分别为6.80%和7.20%;PPV3和PPV6混合感染率为8.00%;3种PPV混合感染率为6.40%。3种PPV均有较高检出率,多种PPV混合感染情况普遍存在,检出率无季节性差异。本研究建立了可用于检测猪源病毒的病毒宏基因组方法和能同时检测3种PPV的多重PCR方法,丰富了本实验室的病原检测技术。