【摘 要】
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目的:结肠癌是一种临床中常见的消化道肿瘤,在全球的发病率较高,位居第三。近几年研究数据显示,我国患结肠癌的患者数量正逐年增加。熊果酸（Uursolic Acid,UA）作为一种中药单体成分,具有镇静、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降低血糖等生物学效应。本研究旨在讨论熊果酸通过下调TGF-β3对结肠癌细胞的作用及可能的作用机制,为熊果酸进入临床应用提供理论依据。方法:1.熊果酸对肿瘤细胞的作用:将人结肠癌HT
【基金项目】
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上海市普陀区临床重点专科-检验医学（2016PTZK09）；
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目的:结肠癌是一种临床中常见的消化道肿瘤,在全球的发病率较高,位居第三。近几年研究数据显示,我国患结肠癌的患者数量正逐年增加。熊果酸（Uursolic Acid,UA）作为一种中药单体成分,具有镇静、抗炎、抗菌、抗肿瘤、降低血糖等生物学效应。本研究旨在讨论熊果酸通过下调TGF-β3对结肠癌细胞的作用及可能的作用机制,为熊果酸进入临床应用提供理论依据。方法:1.熊果酸对肿瘤细胞的作用:将人结肠癌HT-29细胞和SW620细胞分为对照组和熊果酸组,应用不同浓度熊果酸（10μM、20μM、30μM、40μM）作用后,用CCK-8（Cell counting kit-8,CCK-8）法检测熊果酸对两组细胞增殖的抑制作用,并计算出这两种细胞的50%抑制浓度（50%inhibitory concentration,IC50）;流式细胞术检测熊果酸对HT-29细胞周期和细胞凋亡的影响情况;应用qPCR法检测药物作用后两组细胞中凋亡蛋白（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平;qPCR法检测药物作用后HT-29细胞中TGF-β3mRNA、miR-140-5p的表达水平;Western blot法检测TGF-β3蛋白的表达水平。2.熊果酸对TGF-β3信号通路的调控作用:使用TGF-β3的抑制剂2-甲氧基雌二醇（2-Methoxyestradiol,2-Me OE2）,将HT-29细胞分为NC组、2-Me OE2组、UA组和UA+2-Me OE2组,用CCK-8法检测TGF-β3被抑制后熊果酸对HT-29细胞增殖作用的影响,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;qPCR法检测HT-29细胞中TGF-β3、β-catenin、Cyclin D1 mRNA的表达水平的改变。3.熊果酸通过miR-140-5p对TGF-β3的调控作用:构建miR-140-5p过表达和干扰表达模型,将HT-29细胞进行分组,分别是过表达组（mimics NC组和miR-140-5p-mimics组）和干扰表达组（inhibitor NC组和miR-140-5p-inhibitor组）,qPCR法检测药物作用后HT-29细胞中miR-140-5p、TGF-β3 mRNA的表达水平;Western blot法检测TGF-β3蛋白的表达水平;CCK-8法检测miR-140-5p表达改变后熊果酸对HT-29细胞增殖作用的影响,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的影响情况。结果:1.不同浓度的熊果酸均可对人结肠癌HT-29细胞和SW620细胞产生抑制作用,随着熊果酸药物浓度的增加,对细胞的抑制率不断增强;流式细胞术结果显示:HT-29细胞周期阻滞在G1期,随药物浓度的增加,G1期阻滞的细胞增加,细胞凋亡率增加;两种细胞中凋亡相关基因Bax mRNA表达均随药物浓度增加而升高,而Bcl-2 mRNA均表达下降;HT-29细胞中TGF-β3表达随药物浓度增加而降低,miR-140-5p的表达随药物浓度增加而增加。2.CCK-8结果显示2-Me OE2组较NC组熊果酸抑制HT-29细胞增殖的作用增强;流式细胞术显示UA组中的细胞在G1期阻滞的比例和细胞凋亡率较NC组增加,结果和2-Me OE2组一致,且细胞G1期阻滞和细胞凋亡的下降水平尤其以UA+2-Me OE2组作用更明显;UA组中TGF-β3、β-catenin、Cyclin D1 mRNA的表达也较NC组降低,结果和2-Me OE2组一致。3.过表达组中,miR-140-5p-mimics组相比于mimics NC组miR-140-5p的表达增加,TGF-β3表达下降;CCK-8结果显示miR-140-5p-mimics组较mimics NC组抑制HT-29细胞增殖的作用增强,流式细胞术显示miR-140-5p-mimics组G1期阻滞的细胞增加、凋亡率增加;干扰组则相反。结论:1.熊果酸可以抑制人结肠癌细胞的增殖,并能够引起人结肠癌HT-29细胞周期阻滞在G1期,使凋亡相关蛋白Bax表达增加,Bcl-2表达下降,促进细胞发生凋亡。2.熊果酸可通过抑制TGF-β3的表达下调Wnt/β-catenin信号通路,抑制结肠癌细胞的生长。3.熊果酸可通过上调miR-140-5p抑制TGF-β3的表达。
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