本文研究了冷冻保护液组成和冷冻程序对冻存奶牛乳腺组织活力的影响，并通过乳腺组织体外培养模型，研究了培养体系中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸浓度对奶牛乳腺酪蛋白α<,s1>基因表达的影响。 试验一、冷冻保护液组成试验：试验按照3×3两因素试验设计进行，因素一为冷冻保护液中二甲基亚砜浓度，设计为1.0、1.5和2.0mol/L三个水平，每个水平3个重复；因素二为冷冻保护液中蔗糖浓度，设计为0.1、0.2和0.3 mol/L三个水平，每个水平3个重复。结果显示，用含二甲基亚砜2.0 mol/L、蔗糖0.1mol/L的冷冻保护液保存的乳腺组织其琥珀酸脱氢酶活力显著高于其他冷冻保护液(P<0.05)，基因组DNA的降解程度显著低于其他冷冻保护液(P<0.05)。因此，冷冻保护液中含2.0 mol/L，二甲基亚砜、0.1 mol/L蔗糖时，保存乳腺组织可以获得最佳的活性。冷冻程序试验：试验按照2×3两因素试验设计进行，因素一为降温速率，设计为V1(将冷冻管置于4℃平衡30min，直接放入-20℃)和V2(将冷冻管于4℃平衡30min，用一层棉花包裹冷冻管放入泡沫盒中，放入-20℃)，每个处理3个重复。因素二为-20℃保存时间，设计为2、3、4h，每个处理3个重复。结果显示，采用降温速率V2和-20℃保存4h的冷冻程序保存的乳腺组织，其琥珀酸脱氢酶活力显著高于其他冷冻程序(P<0.05)，基因组DNA的降解程度显著低于其他冷冻程序(P<0.05)。因此，乳腺组织经降温速率V2并在-20℃放置4h这一冷冻程序保存后，能够保持最佳的活性。 试验二、试验按照单因素有重复试验设计进行，因素分别为乳腺组织培养体系中赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)浓度，每个氨基酸为一个因素，共有四个试验。乳腺组织培养液中Lys、Met、Thr和Phe浓度分别为170、60、103和105μg/ml。依次分别调整乳腺组织培养液中Lys、Met、Thr和Phe浓度，设计试验组必需氨基酸浓度，Lys浓度设为120、145、170、195、220、245、270μg/ml；Met浓度设为50、60、70、80、90、100、110；Thr浓度设为73、88、103、118、133、148、163μg/ml；Phe浓度设为75、90、105、120、135、150、165μg/ml，每个处理设3个重复。结果显示，乳腺组织培养体系中Lys浓度为195μg/ml、220μg/ml时，乳腺酪蛋白α<,S1> mRNA表达丰度显著高于其他浓度组(P<0.01)。其中Lys浓度为195μg/ml时，mRNA表达丰度最高。通过拟合曲线估算Lys浓度为197μg/ml时，酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度最高。乳腺组织培养体系中Met浓度为110μg/ml时，乳腺酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度显著高于其他浓度组(P<0.01)。通过拟合曲线估算Met浓度为107μg/ml时，酪蛋白α<,s1>mRNA表达水平最高。培养体系中Thr浓度为118μg/ml、133μg/ml时，乳腺酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度显著高于其他浓度组(P<0.01)。其中Thr浓度为133μg/ml时，酪蛋白α<,s1>mRNA表达丰度最高。通过拟合曲线估算Thr浓度为121μg/ml时，酪蛋白α<,s1>mRNA表达丰度最高。培养体系中Phe浓度为120μg/ml和135μg/ml时，乳腺酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度显著高于其他浓度组(P<0.01)。其中Phe浓度为135μg/ml时，酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度最高。通过拟合曲线估算Phe浓度为126μg/ml时，酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度最高。因此，乳腺组织培养体系中Lys、Met、Thr和Phe浓度分别为197、107、121和126μg/ml时，酪蛋白α<,s1>mRNA表达丰度最高综上所述，以DMEM/F<,12>培养液(含2.0mol/L二甲基亚砜、0.1mol/L蔗糖和20％胎牛血清)作为冷冻保护液，采用降温速率V2并于-20℃保存4h后的奶牛乳腺组织能够保持最佳的活性。乳腺组织培养体系中Lys、Met、Thr和Phe浓度分别为197、107、121和126μg/ml时，乳腺酪蛋白α<,s1> mRNA表达丰度最高。