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目的研究ATG16L1及ULK-1等自噬相关基因(ATGs)通过miR-106a相关ceRNA网络调控TLRs负向调控因子SIRPα的表达,进而影响巨噬细胞抗结核分枝杆菌炎症反应的分子机制。方法1.利用LPS、雷帕霉素处理THP-1源性巨噬细胞后,采用RT-PCR检测炎症和自噬模型中miR-106a、SIRPα及炎症细胞因子的表达量。2.利用H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞,通过RT-PCR检测不同感染时间点以及不同感染复数下miR-106a的表达量。3.通过生物信息学软件分析miR-106a对TLRs负向调控因子SIRPα、自噬相关基因ULK-1及ATG16L1的靶向调控作用;通过miRbase等软件将miR-106a与其靶向结合部分进行对比,将SIRPα3’UTR、ATG16L1 3’UTR和ULK-1 3’UTR的野生型及其突变型分别克隆到pMIR-GLO质粒中,完成双荧光素酶报告质粒的构建;通过双荧光素酶报告法和Western blot检测miR-106a对SIRPα、ATG16L1和ULK-1三个基因的调控作用,验证其靶向性,最终通过双荧光素酶法论证ATGs-3’UTR/miR-106a/SIRPαceRNA网络。4.利用H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞,构建结核分枝杆菌感染的细胞模型,将miR-106a mimics、miR-106a inhibitor、miR-106a mimics nc、miR-106a inhibitor nc分别转染到THP-1细胞中,通过Western blot、免疫荧光检测SIRPα的表达量,RT-PCR检测SIRPα及炎性细胞因子的表达量以研究miR-106a对炎症反应过程的调控作用。5.将ULK1 3’UTR及ATG16L1 3’UTR克隆到pEGFP-C1质粒中,构建pEGFP-ULK1和pEGFP-ATG16L1实现ATGs过表达,合成ULK1 siRNA及ATG16L1 siRNA干扰RNA实现ATGs的抑制,分别将其转染进之前构建成功H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞模型中,通过Western blot、免疫荧光检测SIRPα的表达量,RT-PCR检测SIRPα及炎性细胞因子的表达量,确定自噬相关基因ATGs对SIRPα的调控,从而实现对炎症反应过程的调控。结果1.在LPS、雷帕霉素处理THP-1源性巨噬细胞后,与对照组相比,RT-PCR结果显示:LPS组、miR-106a inhibitor与LPS共转染组miR-106a的表达均明显上调;雷帕霉素处理组、miR-106a mimics和雷帕霉素共转染组与其对照组相比,miR-106a的表达均下调。RT-PCR与Western blot结果显示,SIRPα各分组的表达情况与miR-106a的表达相反,且RT-PCR显示炎性细胞因子各分组的表达趋势与miR-106a的一致。2.在H37Ra感染的情况下,RT-PCR结果显示:miR-106a的表达量在不同感染时间及感染复数下均呈现下调的趋势(P<0.05),且在MOI=10时下调程度最大(P<0.001)。3.通过双荧光素酶报告法验证了miR-106a对SIRPα、ULK-1及ATG16L1的靶向性。转染miR-106a mimics的实验分组中,SIRPα、ULK-1及ATG16L1野生型的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),说明miR-106a可靶向抑制其表达。Western blot结果显示,加入miR-106a mimics后SIRPα、ATG16L1和ULK-1蛋白的表达量明显减少,而加入miR-106a inhibitor后其表达量则明显升高,表明miR-106a抑制SIRPα、ATG16L1和ULK-1的表达可能在转录后水平;双荧光素酶法显示,存在ATGs/miR-106a/SIRPαceRNA调控网络。4.为了验证miR-106a对炎症反应的调控作用,首先通过Western blot实验,结果显示转染miR-106a mimics组中SIRPα的表达量明显减少,其次细胞免疫荧光中miR-106a mimics组相较于nc组细胞跨膜蛋白SIRPα发出较弱的绿色荧光,最后通过RT-PCR检测SIRPα的表达量,miR-106a mimics组SIRPα的表达量明显减少,而miR-106a inhibitor组SIRPα的表达量则显著升高。结果表明,miR-106a对炎症反应的调控是通过靶向结合SIRPα并抑制其表达来实现的,从而促进了细胞炎症反应过程。5.为了研究ULK1和ATG16L1等ATGs对炎症反应的影响,Western blot和细胞免疫荧光实验证实所有pEGFP-ULK1组与pEGFP-ATG16L1组炎症反应负向调控因子SIRPα的表达均升高,ULK1 siRNA及ATG16L1 siRNA组中SIRPα的表达降低;RT-PCR同样证实了ATGs抑制炎症反应的作用,pEGFP-ULK1组与pEGFP-ATG16L1组炎症反应负向调控因子SIRPα的表达升高,炎性细胞因子表达量降低表明,ULK1 siRNA及ATG16L1 siRNA组的结果则相反。结果表明ATGs能够通过ceRNA网络竞争miR-106a抑制细胞炎症反应。结论1.LPS、雷帕霉素可改变THP-1源性巨噬细胞中miR-106a、SIRPα及炎性细胞因子的表达量。2.H37Ra感染THP-1源性巨噬细胞可使miR-106a表达量下调。3.miR-106a可靶向抑制SIRPα、ULK-1及ATG16L1基因的表达,并证实ATGs/miR-106a/SIRPαceRNA网络的存在。4.miR-106a可靶向抑制SIRPα的表达,从而实现对巨噬细胞抗结核分枝杆菌炎症反应的调控。5.ULK1与ATG16L1调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌炎症反应是通过ceRNA网络竞争miR-106a的结合位点,从而实现抑制细胞的炎症反应。