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目的:Wnt信号是重要的生命信号通路,在胚胎多器官系统的发生和发育中具有至关重要的作用,而且与多种组织干细胞的自我更新和分化密切相关。本研究拟以斑马鱼为模型,探讨在胚胎早期发育过程中,Wnt信号对胚胎形态发育、中枢神经干细胞功能及神经分化相关转录因子表达的影响,并探究Wnt信号神经分化调控作用的相关机制。方法:(1)在3-72 hpf,斑马鱼胚胎分别暴露于含3μM Wnt信号激活剂BIO或10μM Wnt信号抑制剂IWR的饲养水中,以分别上调和下调Wnt信号通路,并观察胚胎的形态学变化,记录死亡率和孵化率;(2)于2-72 hpf收集经BIO或IWR处理的斑马鱼胚胎,提取总RNA,用于qPCR定量检测Wnt靶基因(Axin2、Lgr6)、胚胎干细胞和神经分化标志基因(Sox2、Shha、Nestin、Eno2、GFAP)、细胞凋亡相关基因(Baxa和Bcl2)表达水平;采用全胚原位杂交技术检测12-48 hpf胚胎中上述基因(Sox2、Shha、Eno2、GFAP、Axin2)的定位表达情况;通过全胚免疫荧光法检测活化的Caspase 3和PH3的水平,以观察细胞凋亡和增殖的变化。(3)使用BIO和IWR分别上调和下调Wnt信号后,定量(2-72 hpf)和定位(12-48 hpf)检测斑马鱼胚胎中枢神经系统中放射状胶质细胞标志基因Pax6、中间前体细胞标志基因Tbr2和转录共激活因子RBM14的定量和定位表达情况;并通过向一胞期胚胎显微注射可特异性敲低RBM14表达的morpholino(MO)寡核苷酸,以观察RBM14表达下调能否引起与Wnt信号过剩导致的Pax6和Tbr2表达相似的改变。结果:(1)Wnt信号激活剂BIO和Wnt信号抑制剂IWR均显著增加胚胎死亡率,诱导胚胎畸形发育,抑制胚胎孵化。(2)BIO所致的Wnt信号激活明显诱导Wnt靶基因Aixn2的表达,但抑制另一Wnt靶基因Lgr6的表达,这一相反的变化与两基因产物在Wnt通路中所起的不同作用密切相关。Wnt信号上调抑制干细胞标志基因Sox2、神经干细胞标志基因Nestin、成形素基因Shha和成熟神经元标志基因Eno2的表达;而星状胶质细胞标志基因GFAP在BIO的作用下出现早期下调,后期上调的表现。(3)在我们所检测的多个基因中,IWR所致的Wnt信号下调使大部分基因出现与BIO所致结果相反的变化(Axin2、Lgr6、Sox2、Shha、Nestin、Eno2),但使星状胶质细胞标志GFAP出现与BIO引起变化一致的改变,这可能与GFAP所标志的胶质细胞系对凋亡的敏感性与其它系细胞不同有关。(4)BIO和IWR均能显著诱导活性Caspase 3的生成、Bax/Bcl2表达比值的上调,及细胞增殖标志PH3的明显抑制,但BIO的作用较IWR的作用更强。这一结果提示,Wnt信号的异常上调和下调均促使斑马鱼胚胎中细胞凋亡的发生和细胞增殖的抑制。(5)Wnt信号过剩明显抑制了Pax6a、Tbr2和RBM14的表达,而Wnt信号受抑则使这些基因的表达出现相反的变化。使用RBM14 MO敲低RBM14的表达,使Pax6a在端脑、前脑和眼部的表达明显受抑,同时使Tbr2在端脑和间脑背侧(嗅球)的表达显著下调,这与BIO引起的Wnt信号上调对Pax6和Tbr2所产生的抑制作用基本一致,但抑制强度不及BIO。结论:(1)在斑马鱼胚胎发育的早期,Wnt信号的异常上调和下调均诱导斑马鱼胚胎大量死亡,并使存活胚胎畸形发育;(2)异常的Wnt信号严重干扰了干细胞的神经分化进程,使得干细胞标志基因、神经分化标志基因出现异常的表达模式;(3)Wnt信号通路的异常变化显著诱导斑马鱼胚胎内细胞凋亡,并抑制细胞增殖;(4)RBM14的下调可能参与了Wnt信号对放射状胶质细胞标志基因Pax6a和中间前体细胞标志基因Tbr2表达的负性调控作用;(5)Wnt信号的正常生理水平对胚胎早期发育至关重要,超出生理范围的异常波动均严重干扰胚胎的正常发育,造成包括神经系统在内的多器官系统发育障碍。