脊柱黄韧带骨化症好发在胸椎特别是下胸椎和胸腰段,骨化的韧带可以导致椎骨局部狭窄脊髓受压,从而产生脊髓压迫和神经根性症状。黄韧带骨化症和后纵韧带骨化症类似,其报道在日本发病率比较高,也有较多的相关研究。1983年日本kudo研究1744个胸段X片后发现黄韧带骨化在日本人群的发病率为男性6.2%,女性4.8%。国内最近的一项研究调查结果显示黄韧带骨化症在南方汉族人群中的发病率为3.8%。黄韧带骨化在老年人群中高发,被认为是一种退变相关的疾病。随着社会人口的老龄化,黄韧带骨化症成为老年人病残的主要脊柱疾病之一,因此对黄韧带骨化症的研究有着现实的意义。黄韧带肥大和骨化的确切病因尚不明确。一些研究表明黄韧带骨化症和后纵韧带骨化(OPLL)以及弥漫性特发性骨肥厚(Diffuse idiopathic skeletal hyperostosis)具有一定的相关性。尽管目前对黄韧带骨化机理研究已经取得很多进展,但是骨化的具体的细胞生物学机制尚不明确。研究后纵韧带骨化过程中的细胞和分子调控通路对预防和控制骨化的发生、发展有着重要意义。病理学的研究发现在黄韧带骨化症样本中的钙化细胞带前存在许多增生的软骨样细胞。目前黄韧带骨化被认为主要是一种软骨内成骨。现有的研究主要着重于研究黄韧带细胞的成骨分化以及认为血管的入侵可能是韧带内异位成骨的原因。但是近来通过对胚胎骨骼起源和生长板发育的生物学研究进展表明软骨内成骨的关键步骤是软骨支架的形成和肥大,而随后的血管侵入后成骨细胞的迁入是软骨肥大后的后继程序化步骤；并且成骨细胞的分化,成熟和募集都依赖于肥大的软骨细胞分泌各种细胞因子。系统通过循环激素和局部因子对生长发育的调控也是作用与肥大的软骨细胞来实现的。在生长板中肥大细胞带的软骨细胞是软骨内成骨的局部指挥中枢。因此同样是软骨内化骨的黄韧带骨化过程同样也可能是受到局部肥大软骨细胞调控。后纵韧带骨化的起因可能不是直接刺激韧带细胞向成骨细胞分化,因为体外研究表明诱导干细胞向成骨分化十分容易,但是缺乏软骨支架的情况下无法形成骨组织。因此调控黄韧带内间充质前体细胞向软骨分化,以及控制软骨细胞的成熟,肥大和死亡是对后继骨化过程调控的可能关键步骤。最近研究表明在软骨内化骨中wnt/β-Catenin信号通路对软骨细胞的成熟分化起到了重要的作用。动物试验也表明wnt/β-Catenin的上调可以导致异位成骨。wnt/β-Catenin信号通路的缺少可以导致发育异常和生长板的畸形。动物实验证实Bmp蛋白的异位诱导成骨也依赖2于wnt/β-Catenin通路的的调控。wnt/β-Catenin对软骨分化的作用未完全明了。一些研究表明wnt/β-Catenin可能对骨关节炎的有一定的相关。wnt/β-Catenin对软骨分化和肥大的作用也存在相反的实验结果。在胚胎相关研究表明wnt/β-Catenint通路抑制软骨分化而促进成骨分化,而其他实验则表明wnt/β-Catenin对软骨分化和肥大起到关键的促进作用。在黄韧带骨化中wnt/β-Catenin扮演的角色还未有研究报道。黄韧带韧带局部的环境因素也影响着细胞的分化和调控。黄韧带骨化好发的下胸椎和胸腰段是脊柱从相对固定的胸段向活动度较大的腰段过渡区域,该区域的黄韧带可能受到较大的牵张应力的影响。此外动物实验也表明局部的反复应力可以导致脊柱韧带内软骨形成。临床也发现存在节短不稳的脊柱韧带骨化的患者中骨化往往发展迅速。之前的实验室细胞学研究也发现牵张应力对脊柱的后纵韧带细胞成骨的促进作用。但是牵张应力对黄韧带细胞分化的具体调控机制尚不明确。近来的研究表明β-Catenin是骨细胞感受机械刺激的通路之一。在黄韧带骨化症中β-catenin信号通路是否参与黄韧带细胞感受机械刺激尚未有研究报道。各种软骨分化及骨系分化相关的细胞因子、转录因子对黄韧带骨化过程中软骨分化和成熟也起到了重要的调控作用。不少研究证实TGF-β、BMP、Run2、Sox9在黄韧带骨化样本中的高表达。这些细胞因子和转录因子和β-catenin通路在黄韧带骨化过程调控中的关系和互相作用尚未有研究报道。本研究通过对来自于黄韧带韧带骨化症患者的样本进行病理组织学研究和体外培养的黄韧带细胞施加牵张应力,来观察β-Catenin及软骨相关转录因子在黄韧带组织中的表达定位,以及牵张应力对调控软骨内化骨的β-Catenin以及软骨分化相关的转录因子Runx2, Sox9以及Osterix影响。从而了解机械牵张应力对黄韧带细胞Wnt/p-catenin信号通路对软骨分化成熟的作用以及β-catenin在力学信号转导过程中的定位和作用。探讨黄韧带骨化过程中,牵张应力可能通过β-Catenin影响软骨分化从而引发软骨内成骨的新调控机制。方法组织学免疫组化自1999-2010共收集到49例胸腰椎黄韧带骨化症患者的组织样本。石蜡包埋后采用苏木素伊红染色,弹性纤维染色Verhoeff-Van Gieson,番红O固绿染色,和DaKo-envison二步免疫组化染色法对β-catenin, Runx2, Sox9, wnt8a, OPN, TGF-β以及Osterix在黄韧带组织中的表达和定位。细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹对研究样本取自于8例有临床胸、腰椎脊髓压迫症状并经影像学和前路手术减压术中证实的黄韧带骨化患者的黄韧带进行体外培养。培养的黄韧带细胞进行细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹测定。体外机械牵张应力对黄韧带细胞表达P-catenin和相关因子影响通过Flexcell牵张应力加载系统对来自于6例黄韧带骨化症患者的体外培养的细胞施加牵张应力,采用细胞免疫组化、RT-PCR、等方法观察机械牵张应力对黄韧带细胞增殖及软骨骨特异性分化指标的影响；研究机械牵张应力对黄韧带细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响以及β-catenin在力学信号转导过程中的定位和作用来观察牵张应力对调控软骨内化骨的β-Catenin以及软骨分化相关的转录因子Runx2, Sox9, OPN, TGF-β以及Osterix影响。结果苏木素伊红染色结果显示黄韧带骨化的患者中在钙化软骨区中存在大量增生肥大的软骨样细胞,韧带的纤维结构被肥大的软骨样细胞所破坏。在韧带于骨的结合区域软骨样圆形细胞明显增加。肥大的软骨样细胞呈圆形或椭圆形,被含有丰富的细胞外基质软骨囊所包裹。对照组正常黄韧带与椎板的结合区域仅有少量零星年的软骨样细胞,韧带纤维的排列具有规则。正常黄韧带的弹性纤维染色结果：弹性纤维排列规则和均匀分布,之间细胞数量稀少,无软骨样细胞。正常的黄韧带椎板结合区域弹性纤维延伸至骨基质表层,黄韧带骨化样本中韧带椎板结合区域弹性纤维排列紊乱,稀疏,弹性纤维之间散步大量软骨样细胞。番红O固绿染色结果：正常黄韧带呈红色,骨组织为绿色,韧带和骨交界区域没有明显的橘红色细胞。黄韧带骨化样本在韧带和骨交界区域存在大量的含有橘红色细胞外基质的软骨样细胞。免疫组化结果：在黄韧带骨化的样本中β-Catenin在未骨化区域的纤维软骨细胞中及靠近软骨区附近的成纤维样细胞中呈阳性,同时在远离钙化区域的梭形和圆形细胞内有少量表达。Sox9主要在钙化带内的软骨样细胞内表达,在靠近潮线附近的肥大的软骨细胞内有微量表达,Runx2只有在骨基质中有阳性表达,主要在骨化部位围绕哈佛氏管成骨细胞内表达,骨基质内有少量表达。TGF-β在退变区域的部分软骨细胞内有少量的表达,而在黄韧带的基质中有轻微的表达。wnt8a在骨化黄韧带和正常黄韧带中均无表达。OPN和Osterix则在纤维软骨和钙化软骨区域表达阳性。在正常黄韧带中,β-Catenin与Sox9表达量很少,Runx2、TGF-β、Osterix OPN阴性表达,均与黄韧带骨化组有显著的差异。黄韧带细胞的形态通过传代培养,成功获得骨化黄韧带细胞和正常后纵韧带细胞各8株。样本组织培养2周后一般就有梭形的成纤维样细胞沿组织块向四周蔓延。各原代细胞培养时间稍有不同从3-4周不等,但传代后细胞生长速度基本类似。骨化组细胞形态大部分形态和正常组类似,但有少量细胞呈大胞体的多角型,平铺于培养皿底部生长较迅速。骨化组和对照组细胞在腔室培养波片上生长良好,存活率分别为99.5%±0.81%和98.7%±0.96%,两组细胞存活率无统计学差异P<0.001。免疫荧光结果黄韧带骨化组β-catenin的荧光强度显著高于对照组,对照组的荧光主要位于细胞膜和细胞互相接触部分。黄韧带骨化组的荧光表达部份表达于核周围。黄韧带骨化组的TGF-β表达高于对照组。蛋白免疫印迹结果β-catenin相对表达量在黄韧带骨化组OLF为4.890±0.5180 N=4;对照组CON为2.728±0.2504 N=4。二者差别具有显著性Students-t检验p=0.009。细胞存活率测定结果：骨化组和对照组细胞在弹性硅胶培养皿内生长良好,施加应力前存活率分别为98.7%±0.71%和97.9%±0.76%。应用应力24h后黄韧带细胞存活率分别为92.4±2.35%和90.4%±2.90%。各时间点两组细胞存活率无统计学差异。细胞组化染色结果：黄韧带骨化组的细胞在Oh时β-Catenin就表现出阳性,在12h时出现强阳性表达。黄韧带骨化组细胞β-Catenin在12h时在细胞核周围出现染色浓聚。Runx2、Sox9、Osterix、OPN、TGF-β的表达在12h出现阳性,24h时阳性增强。对照组仅在24h时胞浆内β-Catenin表现出弱阴性,无细胞核周围浓聚,其他转录因子表现阴性PCR结果：未受牵张应力刺激时黄韧带骨化组细胞β-Catenin、OPN、Runx2 mRNA表达水平较对照组显著升高。在12%的牵张应力刺激6h后黄韧带骨化组β-Catenin. Sox9和Osterix的mRNA表达较对照组明显升高P<0.05。的牵张应力刺激24h后Osterix的mR.NA表达升高最显著P<0.001。对照组细胞的牵张应力刺激6h后Sox9的mRNA表达也明现升高,但是低于黄韧带骨化组,并且没有时间依赖性。结论1.β-Catenin在黄韧带骨化组织中表达阳性。β-catenin可能对黄韧带组织中的间充质细胞的软骨分化或成纤维细胞的软骨化生起到关键的调控。软骨分化相关转录因子Runx2、Sox9、Osterix、OPN在黄韧带骨化过程中对软骨的分化和成熟肥大起到了调控作用,各个因子之间的互相关系还有待研究。做为β-Catenin上游信号之一的Wnt8a阴性表达可能是由于Wnt众多家族中各个蛋白功能不同所至。黄韧带骨化中软骨内成骨的调控的β-catenin上下游通路还需进一步研究。2.在体外培养的来源于黄韧带骨化症患者的黄韧带细胞其β-catenin表达水平较对照组显著升高。β-catenin的上调可能是黄韧带骨化过程中的重要调控环节。3.牵张应力可以引起体外黄韧带细胞中β-Catenin、Runx2、Sox9、TGF-β、OPN和Osterix的表达上调。4.本研究初步证实了牵张应力和β-Catenin信号在调控黄韧带骨化细胞向软骨分化中的作用,为进一步深入探索黄韧带骨化的机制提供了新的视野。