低氧和高氧应力(Hypoxia and Hyperoxia Stress)与一系列病理和生理活动密切相关,比如心肌梗死、脑梗、高压氧治疗、心肌缺血—再灌注等。在这种应力条件下,线粒体功用极为重要,这是因为它能够调节细胞内能量代谢,控制细胞内的氧消耗。然而,其间的分子机制仍待深入发掘。果蝇是一种研究生物遗传和功能的成熟模型,易于进行基因改造；由于空气进入果蝇气管后直接弥散到其组织里,大多数组织可视为直接暴露于环境空气之中,因此果蝇也是研究氧应力变化对器官组织影响的理想模型。我们与加州大学圣地亚哥分校长期合作,通过逐渐减少或增加氧分压和长期筛选的方法,分别培养了低氧和高氧耐受型的果蝇(LOF和HOF)。我们从LOF和HOF中分离出胸肌组织,利用差速离心方法分离组织线粒体。我们采用透射电子显微镜,观察了线粒体的超微结构,发现这两种胸肌线粒体的结构上都有明显不同；LOF线粒体呈现蜂窝状结构和大面积肿胀,线粒体体积增大；而HOF线粒体则有部分的扭曲现象,但线粒体体积基本不变。我们选择针对线粒体呼吸链复合物的专一底物,测定了其催化活性;结果显示,复合物I活性仅在HOF中显著降低,复合物Ⅲ和Ⅳ仅在LOF中升高,而复合物ⅡI活性在LOF和HOF的组织线粒体中都显著降低。这些实验证据提示,通过长期极端氧应力适应,LOF和HOF的线粒体发生了形态和功能变化。我们进一步追问,与这些变化相应的功能性分子基础是什么?我们运用新型的蛋白质相对定量技术iTRAQ,采用严格的统计分析方法,试图较为全面地比较LOF和HOF的差异蛋白质组,进而深入发掘与极端氧应力相关的蛋白质分子的工作机制。利用高精度质谱仪,我们共得到40020张有注释的谱图(FDR<0.01),鉴定到5426个肽段,对应唯一718个蛋白。Pearson相关性分析表明定量蛋白质组数据的质量较高,样品的平行定量测定的回归系数(R2)均高于0.9。以正常组果蝇胸肌线粒体的蛋白质组为参照,LOF和HOF中分别鉴定到55个和75个差异蛋白质。功能分类分析提示,大多数钙调节蛋白、抗氧化蛋白、分子伴侣、线粒体内翻译相关蛋白在LOF中呈现低表达,而这些蛋白在HOF中呈现高表达的趋势；而呼吸链复合物蛋白质在HOF出现明显低丰度,在LOF的丰度变化较小。我们比较了差异蛋白质的丰度分布状态,发现丰度较高的差异蛋白质有较高的比例；其中呼吸链复合物蛋白质在HOF中的比例较高,而膜相关蛋白在LOF中的比例较高。我们还进行了LOF和HOF差异蛋白质的丰度变化与其对应的mRNA的丰度变化相关性分析。结果提示,典型的线粒体蛋白质(如呼吸链复合物蛋白质、线粒体内翻译蛋白质、糖/脂肪代谢相关蛋白质、分子伴侣等)在蛋白质丰度和mRNA丰度上具有很高的相关性；而非典型线粒体蛋白质(如钙调节蛋白质、膜相连蛋白质、肽／氨基酸代谢相关的蛋白质)的丰度和其对应的mRNA丰度则存在很低的相关性。显然,在极端氧应力的适应过程中,转录调节和转录后调节都可能参与了蛋白质丰度及其功能的调节。在LOF的胸肌线粒体中,呼吸链复合物的活性明显异于正常果蝇,但是iTRAQ定量数据表明,LOF的呼吸链复合物的蛋白质丰度大多与正常无异。我们进一步探究造成这一现象的原因。我们采用Blue Native和Western Blot方法检测了线粒体复合物蛋白质的丰度,得到了和定量蛋白质组相当接近的结论,即LOF线粒体呼吸链蛋白质丰度变化不明显。我们运用HPLC技术分析了LOF胸肌组织内的能荷,也没有发现它们呈显著改变。但是,当我们用双向电泳技术分离LOF的胸肌线粒体时,我们的确检测到LOF的双向电泳图谱与正常果蝇有所不同。最为显著的是,许多差异的“串点”出现在正常和LOF果蝇之间。这预示着,蛋白质的修饰反应可能是造成LOF呼吸链功能不同的原因之一。我们选择了一个具有明确生物功能的修饰蛋白质,琥珀酸辅酶A合成酶(SCS),继续探究蛋白质修饰可否引发功能改变。采用SCS抗体跟踪其丰度的改变,我们观察到在SDS-PAGE的Western Blot的结果中,SCS在正常和LOF之间并无显著差别；但在双向电泳的Western Blot的结果中,LOF的SCS的电泳斑点呈现明显的酸移。更为重要的是,SCS在LOF的胸肌组织中的活性显著高于正常果蝇。这样我们推测,LOF胸肌线粒体的呼吸链活性异常并非取决于其复合物成分的丰度高低,而是受到线粒体蛋白质修饰状态的影响。