论文部分内容阅读
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase, GGT, EC:2.3.2.2)可催化谷胱甘肽(Glutathione, GSH)，谷胱甘肽衍生物或其他含γ-谷氨酰的化合物中的γ-谷氨酰基团转移至其他氨基酸、二肽等受体，形成新的γ-谷氨酰基衍生物。利用GGT的转移特性，配合特定供体和受体底物，可生产多种具有高附加值的γ-谷氨酰化合物。其中，以L-谷氨酰胺(L-Gln)为供体底物，乙胺为受体底物利用GGT转化生产L-茶氨酸的研究最为广泛。L-茶氨酸为茶叶中的特征氨基酸，也是其主要呈味物质。研究发现，L-茶氨酸在提神镇静、降低血压、提高认知、增强免疫力以及预防肿瘤发生等方面具有重要生理功能，因此，L-茶氨酸成为日益畅销的天然保健品，市场需求量逐年上升。本研究以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌，对来源于Bacillus subtilis168的GGT进行了克隆表达，并进行发酵优化、纯化和酶学定性。在此基础上，研究了该酶以L-Gln和乙胺为底物合成L-茶氨酸的工艺。本论文主要研究内容如下：(1)实现了GGT在大肠杆菌中的异源表达。以B. subtilis168基因组为模板，通过PCR技术扩增获得全长1260bp的ggt基因片段，以pET-20b(+)为表达载体，构建了含GGT基因的工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-ggt。将重组菌在TB培养基中25℃发酵培养48h，胞外酶活为42.6U·mL-1。(2)重组酶的蛋白纯化和酶学定性。摇瓶发酵后所得酶液进行离心收集，硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析，获得了电泳纯的酶蛋白，比活为136.0U·mg-1。随后，对重组酶进行酶反应动力学研究，以L-γ-谷氨酰基-4-硝基苯胺(L-γ-glutamyl-p-nitroanilide, γ-GpNA)为底物时，测得该酶的Km为2.15mmol·L-1，Vmax为191.30μmmol min-1mg-1；以L-Gln为底物，Km为0.93mmol·L-1，Vmax为95.42μmmol min-1mg-1。对重组GGT进行酶学定性，该酶最适转移活性和最适水解活性pH均为10.0，pH稳定范围较宽。该酶最适作用温度为50℃，在50℃下半衰期达130h。该酶具较好pH和温度稳定性，适合用于L-茶氨酸的生产。(3)重组酶进行摇瓶发酵条件优化。对重组菌进行培养条件和培养基成分的优化，确定其最优培养条件为：37℃，200r min-1培养4h，加入0.2mmol·L-1IPTG，转入25℃培养40-48h；最优培养基成分为(g·L-1)：甘油10，酵母粉21，蛋白胨7，磷酸盐130。优化后胞外酶活达到81.2U·mL-1，较优化前提高了1.9倍，为已报道GGT的最高发酵酶活，为该酶的工业化生产奠定基础。(4)应用重组酶进行L-茶氨酸转化工艺的研究。以L-Gln和乙胺为底物进行酶转化生产L-茶氨酸，最优工艺为：200mmol·L-1L-Gln和1.5mol·L-1乙胺在2U·mL-1的GGT作用下，37℃反应5h，L-茶氨酸产量为156mmol·L-1(27.1g·L-1)，产物对底物L-Gln的摩尔转化率达78%。随后，提高底物浓度，以500mmol·L-1或1mol·L-1L-Gln以及过量乙胺进行转化反应，摩尔转化率分别达58%(50.5g·L-1)和45%(78.3g·L-1)，为大规模酶法合成L-茶氨酸奠定基础。