【研究背景】男性脱发症(AGA)是世界上最常见的皮肤疾病之一,困扰着我国超过1亿的成年男性。且其发病率随着我国社会生活的快节奏化和人口老龄化,而呈现逐渐升高的趋势。已知AGA的主要诱因是雄激素双氢睾酮(DHT)体内浓度改变。另外遗传背景、营养状况、精神压力、衰老程度、免疫反应、外来损伤等因素也在AGA发生和发展中发挥了重要作用。但这种疾病的具体发病机制至今仍不完全清楚。目前临床上可用于治疗AGA的药物仅有抑制DHT生成的Finasteride和血管扩张剂Minoxidil两种。前者有影响男性性功能的潜在副作用,后者在停药后会导致更为严重的脱发,在临床上均难以实现理想的疗效。而开发更为有效的AGA治疗方法将需要我们深入解析AGA的发病机制,并开发其针对性的干预手段。男性脱发具有较为固定的发展模式。一般前额与头顶部最先秃发,而枕后部区域的毛发则保持生长。将枕后部毛囊移植到前额秃发区仍可正常生长毛发,提示毛发生长停滞的根本原因在于毛囊自身而非其周边环境(20世纪50年代提出的“优势供区”理论)。毛发生长由毛囊内部的毛囊干细胞驱动,并随着这些干细胞在激活与静止状态之间的来回切换而呈现出生长-退行-休止的周期性循环。在AGA的发病过程中毛囊逐步萎缩,生长期缩短,休止期延长,最终失去再生毛发的能力。但我们对毛囊干细胞在这个疾病过程中的病理转变过程及其机制仍然缺乏了解。有研究显示脱发区域中的毛囊干细胞并未消失,只是处于异常的休止状态而无法产生毛发。而阐明这种异常休止状态的分子机制将为其针对性治疗方案的开发提供线索。既往文献中对AGA的病理学分析多基于秃发头皮与健康头皮的直接对比。但完全秃发区域的毛囊往往存在结构异常、脂溢、感染、发炎等现象。不易区分导致脱发的直接病理因素与次生现象,也未能阐明毛囊干细胞在AGA发展过程中的病理转变过程。在本课题中,为了深入阐明毛囊干细胞在AGA发病中的病理转变过程及其分子机制,本人将从脱发症患者前额脱发区边缘刚开始毳毛化但尚未完全秃发的临界区域中收集毛囊样品,并与来自同一患者的枕后部未脱发区头皮及健康人头皮的毛囊样品进行对比分析,解析它们在形态结构以及其中毛囊干细胞数量、位置、增殖、分化上的差异。随后,本人还将开发一套从人类毛囊样品中分离纯化毛囊干细胞的有效技术手段,并在国际上首次尝试对脱发临界区及对照区域的毛囊干细胞进行转录组比较分析。通过这些研究,我将进一步揭示AGA发病的毛囊干细胞机制,为开发AGA的新型靶向治疗方案奠定基础。【目的】(1)对比aga脱发临界区、枕后区以及正常人群枕后区的毛囊形态结构及其中的毛囊干细胞数量、位置、增殖、分化之间的差异。(2)建立从头皮样品中分离纯化人类毛囊干细胞的技术体系。(3)建立对微量毛囊细胞进行转录组分析的技术体系,并转录组分析探索aga脱发临界毛囊干细胞与正常毛囊干细胞的基因表达差异。【方法】(1)对aga人群脱发临界区、枕后区与正常人群(男、女)枕后区的毛囊进行解剖观察不同毛囊组间的形态学差异,测量毛囊单位的生长期毛囊数量以及生长期毛囊的长度;通过对不同组间毛囊进行免疫组化分析,分别从毛囊的结构、干细胞、增殖等方面进行对比分析,获得病变与正常毛囊的基本数据,旨在能系统性分析病变与正常毛囊间的大体存在的差异性。(2)拟以显微操作与酶消化法相联合,通过dispaseii分散酶从皮肤中分离毛囊,构建一个毛囊模型。对所构建的毛囊模型分别进行he染色、免疫组化实验,观察毛囊结构,验证毛囊模型的纯度及完整性。通过构建毛囊模型,进一步比较aga临界毛囊、aga枕后毛囊与正常人毛囊的干细胞含量的差异。同时通过磁珠免疫法进一步纯化毛囊细胞,为纯化分离毛囊干细胞提供一种新的方法,并验证此方法的切实可行性。(3)拟以repli-gwtasinglecellkit扩增毛囊微量细胞转录组基因,nebnextdnalibraryprepmastermixsetforillumina试剂盒进行扩增后dna建库。通过nano分光光度计、跑胶法观察获取转录组dna的目的片段,pcr法、ta克隆等方法检验扩增建库水平,探讨通过以上方法进行微量细胞建库的可行性与效率。对比aga前额组(脱发临界)、aga枕后组、正常男性枕后组、正常女性枕后组的基因表达谱分析,将进一步揭示aga发病的毛囊干细胞机制,为开发aga的新型靶向治疗方案奠定基础。【结果】(1)通过测量毛囊单位的生长期毛囊数量以及生长期毛囊的长度发现,aga前额组(脱发临界)毛囊的长度小于aga枕后部毛囊的长度(p=0.0014);aga枕后部毛囊的长度小于正常男性枕后部、正常女性枕后部毛囊的长度(p<0.0001);而正常男性枕后组与正常女性枕后组无明显差异。aga前额部毛囊单位内生长期毛囊的根数比aga枕部(p=0.0005),正常男性枕部(p<0.001)以及正常女性枕部(p<0.001)都少,但其余三组之间无明显差异。(2)分别从毛囊的结构、干细胞、增殖等方面进行对比分析:CK14结构蛋白染色未见四个实验组毛囊之间结构存在明显差异;AGA枕后区、正常男性枕后区及正常女性枕后区的CD200表达均位于毛囊隆突区位置,并且表达较强,AGA前额区隆突区域也明显有CD200的阳性表达,但较其他组明显减弱;AGA枕后组、正常男性枕后组、正常女性枕后组的Ki67阳性表达主要分布在毛球部上方、毛囊下1/4至1/5处,且其的表达量不高,与正常表皮的增殖情况一致。而AGA前额组(脱发临界)的Ki67阳性表达量明显上调,且表达位置分布高至毛囊下1/2处,较其他组位置明显增高。(3)以人头皮毛囊为实验材料时,同时选择“显微分离技术-酶消化”法作为标准化毛囊模型的的制备方法,这种方法制备的毛囊模型结构完整、纯度高、损伤小。(4)通过显微分离技术、酶消化与免疫磁珠联合法获取的毛囊干细胞经过流式细胞仪分析、细胞涂片法染色等方法进行系统评价,发现这种分离纯化毛囊干细胞的策略能进一步纯化毛囊干细胞,细胞损失率降低。(5)以构建的毛囊标准化模型为基础获得的细胞组群进行细胞含量分析,四个实验组毛囊内所含CD200百分比个体差异较大,有可能因为个体差异造成。但每个AGA患者自身比较发现,其枕后部毛囊CD200百分比含量均高于其前额部。(6)通过AGA前额组(脱发临界)、AGA枕后组、正常男性枕后组、正常女性枕后组四组间的基因表达谱分析,发现AGA枕后组基因表达谱与AGA前额(脱发临界)组相近,与其他正常组差异明显。说明AGA枕后区虽然不表现脱发病变,但它仍存在某些显著缺陷。【结论】(1)AGA患者前额组(脱发临界)明显出现生长期毛囊减少,毛囊形状变细、变短。而AGA枕后组较正常人(男、女)也出现了明显的缩短。(2)AGA前额组(脱发临界)CD200干细胞表达量明显减少,增殖细胞Ki67明显增多。(3)选择“显微分离技术-酶消化”法作为标准化毛囊模型的的制备方法,这种方法制备的毛囊模型结构完整、纯度高、损伤小。(4)通过显微分离技术、酶消化与免疫磁珠联合法获取的毛囊干细胞能进一步纯化毛囊干细胞,细胞损失率降低。(5)AGA枕后组基因表达谱与AGA前额(脱发临界)组相近,而与其他正常组差异明显。AGA枕后组也存在某些严重缺陷。