水稻尖细潜根线虫Hm501基因克隆及功能分析

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水稻潜根线虫是一类重要的水稻内寄生线虫,危害全世界至少58%的水稻田,引起高达25%的损失。江西省是水稻种植大省,水稻尖细潜根线虫在江西水稻产区危害严重。为寻求安全、高效的防治办法,了解水稻尖细潜根线虫的致病机制十分重要。为进一步深入研究尖细潜根线虫侵染水稻的致病机制,本研究通过RNA-seq技术分别对接种抗性品种“RN51”水稻、感病品种“RN155”水稻和未侵染水稻的尖细潜根线虫(Hirschmanniella mucronata)进行转录组测序,分析尖细潜根线虫在侵染抗感水稻时的转录本数据,获得了10794个上调差异表达基因,5531个下调差异表达基因。从上调表达基因中筛选得到预测表达于线虫食道腺的潜在效应基因Hm501,进行基因的克隆与功能分析。通过RT-PCR技术克隆获得Hm501基因c DNA全长序列,Hm501开放阅读框为732 bp,编码243个氨基酸,预测N端含编码24个氨基酸残基的信号肽,C端含有CXXC活性位点的Rdx结构域,推测其功能可能与蛋白质合成与折叠相关。原位杂交显示,Hm501在水稻尖细潜根线虫亚腹食道腺细胞特异表达。构建植物表达载体进行烟草瞬时表达,结果发现Hm501定位于内质网,不引起本氏烟过敏性坏死反应,也不抑制由BAX介导的细胞程序性死亡。线虫接种试验发现RNAi转基因水稻能够有效沉默Hm501基因表达,降低水稻尖细潜根线虫侵染能力。构建了Hm501蛋白原核表达载体并进行诱导条件的优化,结果表明15℃,0.5 m M IPTG诱导16 h为Hm501蛋白出现可溶表达的最佳诱导条件。大量表达并纯化后获得Hm501蛋白,将Hm501蛋白与水稻根蛋白共同孵育,进行pull-down试验筛选互作蛋白。经SDS-PAGE检测得到多个特异性条带,需进行潜在互作蛋白质谱鉴定。综上,Hm501基因在水稻尖细潜根线虫侵染水稻时发挥了重要作用,需进一步分析Hm501蛋白的潜在互作蛋白信息以及它们之间的作用机制,从而明确该基因在线虫侵染过程中发挥的具体功能。
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