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LIGHT是肿瘤坏死因子超家族第14个成员,在活化树突细胞、共刺激T细胞以及诱导肿瘤细胞凋亡等方面有着重要作用。猪是既是重要的肉类来源,也是研究人类相关疾病的动物模型。所以本课题以猪作为研究对象,对猪LIGHT基因进行了克隆表达以及生物学性质鉴定。首先,我们分析了猪LIGHT的基因序列,与其他肿瘤坏死因子超家族成员一样,猪LIGHT也是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,含有一个预测的跨膜区、一个金属酶切位点、两个保守的半胱氨酸残基以及一个TNF同源结构域。为了研究LIGHT与免疫系统的关系,我们融合了猪LIGHT的胞外段(psLIGHT)和Fc片段,构建了一个新的蛋白分子psLIGHT-Fc。大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统,以其低成本,高生产率,操作简单等优点而备受亲睐,所以我们设计带有限制性酶切位点的引物,通过Overlap-PCR方法获得psLIGHT-Fc基因,酶切后插入pET28a原核表达载体中,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3),经Protein A亲和层析柱纯化得到约44.3KDa的psLIGHT-Fc蛋白,并且对其进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。psLIGHT-Fc蛋白既能够与ProteinA柱紧密结合,大大简化纯化过程,又可以通过Fc标签与相应抗体结合,能够快速方便地利用流式细胞法和激光共聚焦法检测其活性。此外,通过MTT法初步检测,在anti-CD3分子的共刺激下,psLIGHT-Fc能够促进小鼠T淋巴细胞增殖。本实验的研究结果可以为研究LIGHT与免疫系统的关系奠定理论基础。另外,我们克隆了鳜鱼的GILT基因(mGILT)。通过RT-PCR和RACE技术,从鳜鱼的脾脏组织中扩增了长度为1008 bp的GILT基因,包括771bp的开放阅读框、21bp的5’端非编码区和210bp的3’端非编码区。通过Clustalw、MEGA4.0软件和Protparam在线工具对mGILT进行生物信息学分析。同时通过荧光定量PCR分析了 mGILTmRNA在不同组织中的表达分布。此外,我们构建了 pET28a-mGILT表达质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得了重组的mGILT蛋白,并对其进行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。最后,以人的IgG作为底物,研究了 mGILT的巯基还原酶活性。研究结果表明,mGILT能够还原蛋白二硫键,在鱼类免疫防护系统中具有重要作用。