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结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的传染性疾病,具有较高的发病率和死亡率。据估计全球有1/3人群携带结核杆菌却无明显的临床症状,处于结核感染潜伏期。潜伏期结核杆菌存在于一种叫肉芽肿组织的微环境中,结核杆菌在此低氧、营养物质缺乏以及NO升高的微环境中,通过上调一组含有48个基因的结核休眠生存调节子(DosR)的表达,调节结核杆菌的生理活动,使之进入休眠期,并在肉芽肿组织环境中存活下来。本研究选取的三种结核DosR蛋白Rv2626c(hrp1)、Rv2029c(pfkB)和Rv2032(acg),均可以在人体中产生强烈免疫应答。目的:1.探索DosR蛋白在结核潜伏期的生物学作用;2.探讨潜伏期表达的DosR蛋白作为抗原能否引起巨噬细胞产生免疫应答,以及产生免疫作用的具体机制;3.探索结核DosR蛋白能否作为新型的结核保护性疫苗。方法:1.通过文献检索和生物信息学分析的方法,选取DosR三种基因Rv2626c(hrp1)、Rv2029c(pfkB)、Rv2032(acg)。2.采用基因工程技术,将三种基因扩增纯化并与载体pET30A进行连接,构建重组质粒,并成功导入工程菌中。在IPTG的诱导下,表达三种蛋白,并利用镍亲和层析的方法对蛋白进行纯化,对于表达在包涵体中的蛋白,采用透析的方法进行复性,最终获取纯度较高的蛋白Rv2626c、Rv2029c、Rv2032.。3.利用大肠杆菌平台期模拟肉芽肿微环境,将重组质粒Rv2029c导入工程菌BL21中,观察DosR蛋白Rv2029c对大肠杆菌生长的影响,分析蛋白Rv2029c在潜伏期结核杆菌肉芽肿环境中可能的生物学作用。4.THP-1细胞系通过佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞,并用DosR蛋白对巨噬细胞进行刺激,模拟天然免疫过程,观察DosR蛋白对巨噬细胞天然免疫的影响,揭示DosR蛋白引起天然免疫的机制5.建立小鼠体内呼吸道感染模型,将DosR蛋白接种到小鼠体内,之后进行BCG感染,观察DosR蛋白能否引起小鼠产生免疫应答,评价DosR蛋白作为新型的保护性疫苗的可能性。结果:1.成功构建重组质粒pET30A-Rv2626c、pET30A-Rv2029c、pET30A-Rv2032,诱导表达出三种蛋白:Rv2626c、Rv2029c和Rv2032,蛋白电泳获得条带单一,表明蛋白纯度较高。2.DosR蛋白Rv2029c能够显著提高大肠杆菌增殖量,使其突破其生长界限,延长对数期,增强大肠杆菌在低氧应激状态下的生存能力;3.体内实验结果表明:与对照组(pbs组)相比,DosR蛋白Rv2626c可能诱导小鼠Th2型免疫反应,TGF-β表达量显著增加,导致结核杆菌产生免疫逃逸;4.体外实验结果表明:DosR蛋白Rv2029c和Rv2032均能通过识别并上调TLR2的表达,使NF-κB磷酸化水平升高并进入细胞核,刺激巨噬细胞产生促炎因子(TNF-α,IL-1β,IL-6等),产生免疫保护作用。结论:1.蛋白Rv2626c可能通过诱导Th2型免疫反应,增加TGF-β的表达,使结核菌产生免疫逃避:2.蛋白Rv2029c可能在潜伏期肉芽肿环境中增强结核杆菌在低氧应激状态下的生存能力,从而使结核菌转入休眠期:3.Rv2029c和Rv2032通过TLR2途径活化巨噬细胞,刺激促炎因子释放,发挥免疫保护作用。4.结核DosR蛋白Rv2032可以引起机体产生免疫保护,可以作为候选的保护性疫苗,值得进一步开发。