以苏云金芽孢杆菌产生的毒素作为生物杀虫制剂或产品是非常有效的一种防治害虫的手段。Cry毒素就是其中一种被广泛应用的杀虫制剂原材料。Cry毒素属于成孔毒素中的一种,它在昆虫体内的主要膜穿孔方式与其他成孔毒素十分类似,都是先活化释放出毒素单体,然后毒素单体寡聚化形成穿孔复合物前体,随后插入到细胞膜上导致细胞渗透压升高而破裂死亡。Cry毒素是一个大家族,有很多毒素类型及其功能已经被鉴定,但也有一部分未被完全鉴定。Cry2A系列毒素的活化机制除Cry2Ab外没有被完全证明和研究。因此我们选择Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah这四种Cry2A系列毒素作为研究对象,想要探究它们的活化机制,同时也希望可以找到能够大幅提升杀虫活力的Cry2Ab的突变体,从而可以使其应用于其它产业,如杀虫剂等。在实验室前期的研究成果中我们可以发现Cry2Ab原毒素在活化时有两个关键的酶切位点,这两位点在连接α-4螺旋和α-5螺旋的loop环上,分别为Arg139和Leu144。本文以这一结果为理论基础,以Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah四种蛋白为实验材料,研究Cry2A系列蛋白的活化及杀虫机制。主要研究结果如下:1.构建了 Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah的单个和两个酶切位点突变的突变体,包括Arg139酶切位点突变的突变体R139A,Leu144酶切位点突变的突变体L144A,以及Arg139和Leu144酶切位点全部突变的突变体R139A-L144A。胰蛋白酶活化实验结果表明,原毒素和酶切位点单突变的Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah毒素都能被胰蛋白酶活化;胰蛋白酶参与了 Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah原毒素的活化,可以在Arg139和Leu144对原毒素进行切割。2.Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah作为同系列蛋白,胰蛋白酶酶切位点完全相同,但在Cry2Af在诱导表达蛋白以及纯化过程中会表现出表达蛋白以及纯化效率低的特点。3.活化状态下的Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah才能够发挥它们的杀虫毒性。当 Cry2Ab、Cry2Ad、Cry2Af、Cry2Ah 的 Arg139 和 Leu144 这两个酶切位点同时发生突变或被破坏时,那么杀虫能力则会受到严重影响且杀虫毒力与被活化的原毒素相比大打折扣。4.根据实验室前期研究结果,构建参与Cry2Ab毒素活化过程的关键氨基酸残基的突变体,并进行杀虫活性验证,可以看到183、184和187、188这两组关键氨基酸残基发生突变后,可以有效提高Cry2Ab的杀虫活性。本实验旨在了解和探究Cry2A系列蛋白的膜穿孔机制之间是否存在差异,以期完善Cry2A毒素的膜穿孔模式,为Cry毒素的定向改造和延缓害虫抗药性等研究提供理论支持,这对于Cry2A毒素在新型农药研发和生产、推广应用等方面而言是非常有意义的。