【摘 要】
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1目的本研究基于m6A甲基化修饰酶-（Methyltransferase-like 3,METTL3）深入探索双糖链蛋白聚糖（Biglycan,BGN）的差异甲基化修饰在浸润性膀胱癌中免疫细胞浸润调控中的作用机制,主要分为三部分。第一部分:生物信息学分析并验证BGN与m6A RNA甲基化修饰酶-METTL3在浸润性膀胱癌中的表达。第二部分:BGN和METTL3在膀胱癌发生发展中的作用。第三部分:M
【基金项目】
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广东省基础与应用基础研究基金项目（编号:2020A1515110117）；
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1目的本研究基于m6A甲基化修饰酶-（Methyltransferase-like 3,METTL3）深入探索双糖链蛋白聚糖（Biglycan,BGN）的差异甲基化修饰在浸润性膀胱癌中免疫细胞浸润调控中的作用机制,主要分为三部分。第一部分:生物信息学分析并验证BGN与m6A RNA甲基化修饰酶-METTL3在浸润性膀胱癌中的表达。第二部分:BGN和METTL3在膀胱癌发生发展中的作用。第三部分:METTL3介导BGN m6A甲基化调控免疫细胞浸润的分子机制。2方法第一部分 利用TCGA数据库,分析BGN及METTL3在膀胱癌中的表达;结合组织芯片的免疫组化实验检测BGN及METTL3在膀胱癌中的表达。第二部分 在膀胱癌细胞系中进一步验证BGN及METTL3的表达。构建BGN及m6A RNA甲基化修饰酶的全长cDNA野生型和CRISPR-Cas9 sgRNA表达质粒,通过慢病毒系统,建立BGN、METTL3敲除的稳定细胞株,通过细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭实验研究METTL3及BGN表达对膀胱癌细胞株的影响;通过整体动物实验探讨其对膀胱癌细胞株在动物体内的生长、转移的作用。第三部分 应用荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光、RNA免疫沉淀、RNA甲基化免疫沉淀等技术分析调控BGN m6A修饰的甲基化酶、去甲基化酶和甲基化结合蛋白;TCGA数据库分析BGN表达与免疫细胞表达之间的相关性;通过细胞共培养、蛋白互作分析及蛋白免疫共沉淀等实验验证BGN对巨噬细胞的募集能力并探讨其机制。3 结果1.第一部分生物信息学分析显示METTL3、BGN在膀胱癌组织中高表达,且与预后不良相关。组织芯片免疫组化实验结果验证了METTL3、BGN在膀胱癌组织中表达升高。2.第二部分研究发现在5637及UM-UC-3膀胱癌细胞系中METTL3及BGN的表达均显著升高,接着,研究基于CRISPR-Cas9技术构建敲除及过表达METTL3、BGN的质粒并成功转染膀胱癌细胞,western blot结果显示METTL3可往下游直接或间接调控BGN的蛋白表达。体外细胞功能实验显示敲除METTL3及BGN后膀胱癌细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低。裸鼠皮下成瘤及尾静脉注射实验结果显示,敲除METTL3及BGN后可影响膀胱癌在体内的增殖、迁移及侵袭潜力。3.第三部分 研究通过MeRIP、蔗糖梯度离心以及RIP等实验研究了METTL3可修饰BGN mRNA上的m6A甲基化位点,这些修饰位点可与RNA结合蛋白YTHDF1结合,进而提升BGN的蛋白翻译效率。在5637细胞及UM-UC-3细胞中的功能实验也表明,在敲除METTL3的前提下过表达BGN可部分回复肿瘤恶性能力。通过CIBERSORT算法分析了 BGN同免疫细胞浸润之间的联系,发现BGN表达水平同CD8+T细胞、活化的树突状细胞等免疫细胞呈现明显的负相关性,同巨噬细胞M0型呈现显著的正相关（P＜0.05）,且通过细胞共培养、蛋白互作分析及蛋白免疫共沉淀实验证明BGN可作为TLR2及TLR4的配体进而发挥募集巨噬细胞并促进其分化的功能。4 结论第一部分METTL3及BGN在膀胱癌中表达水平升高,且与不良预后相关。第二部分METTL3及BGN可提高膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。第三部分METTL3可调控BGN mRNA m6A甲基化修饰水平进而正向调控其蛋白表达,BGN可通过与TLR2及TLR4的结合进一步募集巨噬细胞浸润,促进膀胱癌恶性进展。
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