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研究目的:细胞周期蛋白CCND1是保证DNA复制和细胞有丝分裂准确进行的一个重要调控点。CCND1在生长因子的刺激下,与细胞周期蛋白激酶CDK4/6结合形成复合物后,磷酸化视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白Rb,使转录因子E2F游离出来,从而使得细胞周期由G1期进入S期。在正常生理情况下,细胞周期进入S期后,CCND1就会通过泛素蛋白酶体途径发生降解,但是在肿瘤组织中CCND1降解途径受到破坏,CCND1蛋白大量蓄积,使得细胞增殖不受控制。因此,CCND1的泛素蛋白酶体途径在肿瘤的发生发展中起着关键作用。然而,有关增加CCND1稳定性的去泛素化酶研究较少。本研究旨在发现CCND1的去泛素化酶,并探索其作用机制,为神经胶质瘤细胞的治疗提供新的方向。研究方法:1.通过免疫共沉淀方法,在HEK293T细胞、U251细胞以及HS683细胞中验证USP10与CCND1蛋白是否存在相互结合;2.在过表达或敲低USP10后,采用Western Blot方法从内源性和外源性两方面探讨USP10对CCND1蛋白表达量的影响;3.通过免疫共沉淀技术检测USP10对外源性CCND1蛋白泛素化以及泛素化类型的影响。构建USP10慢病毒并侵染神经胶质瘤U251和HS683细胞,探索USP10对内源性CCND1蛋白泛素化的影响;4.运用放线菌酮和蛋白质免疫印迹方法检测USP10对CCND1蛋白稳定性和半衰期的影响;5.通过CRISP Cas9技术,构建USP10慢病毒侵染神经胶质瘤U251和HS683细胞,并运用WB技术和流式细胞术分析敲低USP10对神经胶质瘤细胞凋亡的影响;6.运用MTT 比色方法及WB技术,从小分子药物库中筛选USP10的抑制剂,并检测小分子化合物对CCND1和USP10蛋白表达量以及泛素化的影响;7.使用RT-PCR技术分析小分子化合物对USP10和CCND1mRNA表达水平的影响;8.通过流式细胞术,分析小分子化合物对神经胶质瘤U251和HS683细胞凋亡的影响。实验结果:1.在细胞中过表达USP10蛋白后,用免疫共沉淀实验检测到CCND1蛋白的表达,表明USP10和CCND1能够相互结合。2.在细胞中过表达USP10和CCND1后,免疫共沉淀实验表明USP10降低了CCND1的多聚泛素化,表明USP10能增加CCND1蛋白的稳定性。同时进一步研究发现,USP10的泛素化位点以K48位为主。3.过表达USP10和CCND1后,USP10可以明显增加CCND1的蛋白水平,且呈浓度依赖性,表明USP10通过泛素蛋白酶体途径抑制CCND1蛋白的降解,增加蛋白的表达量。4.CHX实验结果表明USP10可以增加CCND1的稳定性,并且延长CCND1蛋白的半衰期。5.敲低USP10后,蛋白免疫印迹实验发现,敲低USP10可以降低CCND1的蛋白水平,同时流式细胞术结果表明,敲低USP10可以诱导神经胶质瘤细胞的凋亡。6.通过MTT和WB实验发现能够靶向USP10的小分子化合物:乙酰缬草三酯(Acevaltrate,AVT),AVT能够明显降低USP10和CCND1的蛋白水平,同时实验结果表明,AVT能够增加CCND1蛋白的泛素化,但是其泛素化水平的增加可以被USP10所逆转。7.RT-PCR实验结果表明,AVT不影响USP10和CCND1的mRNA的表达水平。8.流式细胞术和MTT实验表明,AVT能够诱导U251细胞和HS683细胞的凋亡,抑制细胞的增殖,发挥抗神经胶质瘤的活性。结论:1.USP10能够与CCND1发生相互结合。2.USP10与CCND1结合后通过抑制内源性CCND1的多聚泛素化,增加了CCND1蛋白的稳定性。敲低USP10时即可通过降低CCND1的蛋白水平来诱导神经胶质瘤细胞的凋亡,发挥抗神经胶质瘤作用,为临床治疗神经胶质瘤提供新的策略。