【摘 要】
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克里米亚-刚果出血热（Crimean-Congohemorrhagic fever,CCHF）是由克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）引起的蜱传病毒性疫病,致死率为20%-30%,广泛流行于亚洲、欧洲、非洲等多个地区。近年来,该病有向更广的范围扩散的趋势,因此研究这种疾病的对公众健康具有重大意义。研制疫苗是控制CCHF传
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目编号31760736），内蒙古和新疆地区蜱虫携带人畜共患病毒的病原生态学与分子流行病学研究； 国家自然科学基金（项目编号32130104）,草食家畜携带病毒的病原生态学与分子流行病学研究；
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克里米亚-刚果出血热（Crimean-Congohemorrhagic fever,CCHF）是由克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）引起的蜱传病毒性疫病,致死率为20%-30%,广泛流行于亚洲、欧洲、非洲等多个地区。近年来,该病有向更广的范围扩散的趋势,因此研究这种疾病的对公众健康具有重大意义。研制疫苗是控制CCHF传播的主要措施,1970年苏联批准使用的灭活疫苗,仅能引起部分CCHF患者的体液免疫;2006年研制的CCHF核酸候选疫苗因不能有效进入细胞而被核酸酶降解;2010年研制的CCHF活载体疫苗能保护部分小鼠免受CCHFV的感染,但载体的抗性影响疫苗的免疫效果等缺陷,致使目前仍缺乏安全有效的疫苗来预防这种疾病。杆状病毒表面展示疫苗和Zera纳米颗粒疫苗可以避免这些缺点,尤其是其自身具有佐剂性质和安全性。基于此,本研究以昆虫杆状病毒表面展示系统和Zera自组装系统分别表达中国新疆株HANM-18（MN832721）的刺突蛋白Gn和核衣壳蛋白Np,制备了 rvAc-Gn、rvAc-Np、rvAc-Gn-Np、Zera-Gn和Zera-Np5种纳米颗粒,并将其作为候选疫苗免疫BALB/c小鼠,在小鼠体内评估免疫效果。通过实验,获得如下结果:1.构建CCHFV Gn和Np蛋白的原核表达体系,将表达纯化获得的Gn和Np蛋白作为免疫原免疫兔子,制备Gn和Np的兔多克隆抗体,间接ELISA法检测Gn效价为1:524288,Np兔多克隆抗体效价为1:1048576,可供后续实验使用。2.在杆状病毒表达系统中构建携带有Gn-mCherry和Np-eGFP的表面展示载体和Zera自组装载体,并将其转染 Sf9 细胞,获得 rvAc-Gn-mCherry、rvA c-Np-eGFP、rvA c-Gn-mCherry-N p-eGFP、Zera-G n-m Cherry 和Zera-Np-eGFP 5种荧光纳米颗粒,通过直接荧光和间接荧光确定5种纳米颗粒均能在细胞内表达;通过免疫电镜对展示纳米颗粒观察,确定Gn和Np蛋白展示于杆状病毒表面。3.对上述载体去荧光标签改造;转染Sf9细胞,得到rvAc-Gn、rvAc-Np、rvAc-Gn-Np、Zera-Gn 和 Zera-Np 5 种纳米颗粒,将 Western Blot 鉴定正确的纳米颗粒作为疫苗免疫 BALB/c 小鼠,间接ELISA结果表明,与PBS和野生型杆状病毒组相比,首次免疫42d的Gn和Np的展示颗粒和Zera自组装颗粒均可以诱导小鼠产生高水平的体液免疫（P＜0.001）;脾淋巴细胞增值实验结果表明:5种纳米颗粒均可以诱导小鼠产生显著的细胞免疫,并提升小鼠IL-4和TNF-α的表达水平（P＜0.001）;有趣的是,与对照组相比,rvAc-Gn-Np二联展示颗粒脾淋巴细胞刺激指数明显升高,但IL-4和TNF-α表达水平与对照组无差异,说明Gn-Np的共同展示策略不可用。在杆状病毒表面展示和自组装两种表达策略中,Gn蛋白的免疫原性均显著高于Np蛋白,并且Zera自组装颗粒能显著提升Gn和Np的细胞免疫水平。综上所述,杆状病毒表达系统Zera自组装颗粒能显著提升Gn和Np蛋白的免疫原性,并且Gn的免疫原性显著强于Np;Zera-Gn在体液免疫和细胞免疫水平显著其他组,表明Zera-Gn自组装纳米颗粒疫苗有作为CCHF候选疫苗的潜力;同时该研究为CCHF杆状病毒Zera自组装纳米颗粒疫苗和表面展示疫苗研制提供理论参考。
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