研究背景： 异丙酚(propofol)又名得普利麻，化学名称2,6二异丙基苯酚，是一种惰性的酚类衍生物，具有起效快、时效短、苏醒迅速、苏醒后意识清晰等优点，已广泛用于脓毒症、严重创伤等重危病人及ICU有监测条件下的麻醉和镇静。近年有大量研究表明异丙酚可有效抑制创伤、手术等过程中的炎症反应，其控制LPS引起的炎症反应作用也越来越引起关注。但异丙酚控制LPS引起的炎症反应的保护机制尚不清楚，目前认为大概有以下几个方面参与了这一过程： 1、异丙酚抑制炎性细胞因子的产生； 2、异丙酚能够清除氧自由基，具有抗氧化作用； 3、异丙酚能够抑制一氧化氮(nitricoxide，NO)的产生。 蛋白质组学研究技术主要包括四个方面： (1)蛋白质分离技术； (2)蛋白质鉴定技术： (3)蛋白质相互作用的研究技术； (4)生物信息技术。 研究目的： 1，观察异丙酚对LPS诱导THP1细胞释放细胞因子的变化。 2，研究异丙酚影响LPS刺激THP1细胞作用的蛋白质表达谱的变化。 研究方法： 1，异丙酚对LPS诱导THP1细胞释放细胞因子的变化：将体外培养的THP1细胞分为对照组，1μg/mlLPS刺激组，1μg/mlLPS加50μmol/L屏丙酚组，用LiquiChip液相蛋白片系统检测三组处理因素作用THP1细胞12h时对分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。并用不同浓度的异丙酚(0，12.5，25，50，100μmol/L)同1μg/mlLPS联合刺激培养好的THP1细胞，以未加任何刺激的THP1细胞为对照，分析异丙酚对THP1细胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α影响的剂量效应。 2，异丙酚影响LPS刺激THP1细胞作用的蛋白质表达谱的变化 (1)将体外培养好的THP1细胞分为空白对照组，1μg/mlLPS刺激组，1μg/mlLPS加50μmol/L异丙酚组。刺激12h后，1000rpm离心10min，弃上清，将细胞沉淀置液氮中冻存，供下一步蛋白质双向凝胶电泳检测用。 (2)将上述THP1细胞进行总蛋白质提取，双向电泳(2-DE)，利用UMAXPowerLook1100透射扫描仪获取图像，用PDQwest7.1.0软件包进行图像分析，分析包括蛋白质斑点的检测、量化、背景去除和点的匹配，找出三组图谱中的差异蛋白质点。 (3)将差异蛋白质点进行胶内酶切与MALDI-TOF质谱分析。 (4)对所得的肽质量指纹图谱进行数据库分析，明确蛋白质的类型及性质。 (5)应用WesternBlot对数据库检索出的部分蛋白进行验证。 (6)查询文献分析筛选获得的差异表达蛋白质功能，结合上述与这些蛋白质相互作用蛋白质的分析，选择功能上具有联系的蛋白质，运用String数据库及其软件进行相互作用分析，预测是否有蛋白质作用对存在。 结果： 1，异丙酚对LPS诱导THP1细胞释放细胞因子的影响 (1)LPS诱导THP1细胞释放细胞因子以及异丙酚对其的影响：与对照组相比，LPS组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α明显增高(P<0.01)；而GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-1β、IL-2、IL-4的变化无统计学意义(均P>0.05)。与LPS组相比，LPS加50μmol/L异丙酚组THP1细胞释放IL-6、IL-8和TNF-α明显降低(均P<0.01)。 (2)异丙酚对LPS诱导THP1细胞释放IL-6、IL-8和TNF-α的量效关系：结果发现异丙酚浓度为12.5μmol/L时就显示出对LPS诱导IL-6、IL-8和TNF-α释放的抑制效应，分别从刺激后的266±78pg/ml、1552±279pg/ml、1787±388pg/ml减少到201±67pg/ml(P<0.01)、1364±157pg/ml(P<0.05)、1203±265pg/ml(P<0.01)，随着异丙酚剂量的增加，三者的释放进一步显著减少，至异丙酚浓度为100μmol/L时三种细胞因子的浓度分别是34±12pg/ml、627±135pg/ml、203±72pg/ml，已基本接近正常对照组水平(P>0.05)。将异丙酚浓度与IL-6、IL-8、TNF-α值做Linearity线性趋势分析显示其F及P值分别为(129.61，0.00)、(163.01，0.00)和(259.96，0.00)，说明随着异丙酚剂量的增加，三者的释放呈递减趋势。 2，异丙酚影响LPS刺激THP1细胞作用的蛋白质表达谱的变化 (1)三组双向凝胶电泳图像清晰，没有背景条纹的干扰，蛋白质斑点分离完全，在相同条件下，反复3次重复的实验结果图大致相同，三组图谱图象分析后平均检测到101016个蛋白质斑点。选取对照组图谱作为参考胶，其它两组胶与参考胶匹配，使各凝胶中的蛋白质斑点与参考胶中的对应起来，与参考胶中同一蛋白质斑点相匹配的点为同一种蛋白质。匹配结果显示三组胶蛋白质斑点匹配百分率约为79.84％。 (2)选择9个在三组中出现较大变化趋势的蛋白斑点进行质谱鉴定，获得有效鉴定的四种蛋白质分别为Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1和programmedcelldeath6。经查阅文献，发现其中Stathmin1与programmedcelldeath6功能上相关，生物信息学分析也提示二者存在间接的相互作用。 结论： 1，LPS可诱导THP1细胞多种细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，异丙酚可以剂量依赖的方式抑制IL-6、IL-8和TNF-α的释放，这可能是其在内毒素血症的发生和发展中发挥保护作用的分子机制之一。 2，建立了重复和稳定性较好的单核细胞蛋白质的提取方法和2-DE方法，并对通过质谱鉴定出的2个差异表达蛋白用western-blot技术进行了更进一步的验证，与2-DE结果完全一致，从而证明了2-DE结果的可靠性。 3，运用蛋白质组学研究获得有效鉴定的蛋白质中有三种蛋白Stathmin1、ubiquitin-conjugatingenzymeE2N、ChainA，1113tMutantOfHumanSod1在LPS刺激THP1细胞后表达上调，而同时给予异丙酚处理后下调，另外一种蛋白质programmedcelldeath6正好与上述趋势相反。 说明这四种蛋白质在异丙酚抗LPS引起的炎症反应过程中发挥重要作用。经查阅文献，发现Stathmin1与programmedcelldeath6功能上相关，生物信息学分析提示二者存在间接的相互作用。上述结果提示我们这四种蛋白质可能在以下方面产生影响。 (1)维持细胞内环境的稳定：在内毒素休克过程中，由于呼吸爆发的产生，大量的氧自由基产生，对组织和细胞产生氧化损伤，因此对抗超氧化的物质也增多，如SOD1。为了抵抗氧自由基的损伤作用，SOD1表达增加，以清除过多生成的氧自由基。当给予异丙酚处理后，由于异丙酚能够抑制细胞中的活性氧产生，于是能够有效抵抗LPS通过产生氧自由基而引起的细胞损伤作用。当异丙酚的清除氧自由基作用发挥效力时，活性氧产生不异常增加，不会诱导SOD1表达上调。LPS刺激THP1细胞后细胞内环境会处于不稳定状态，ubiquitin-coniugatingenzymeE2N上调表明由于LPS刺激，细胞对短寿蛋白的降解清除活跃，这样就可能破坏细胞内环境的稳定，而在LPS刺激同时给予异丙酚处理后，ubiquitin-conjugatingenzymeE2N有恢复趋势，表明细胞对短寿蛋白的降解清除受到了抑制，因此细胞的内环境趋向于向稳定的方向，有助于细胞行使其正常功能。 (2)恢复单核细胞的凋亡障碍：在生长发育、组织细胞增殖过程中，分化和细胞死亡是处于平衡之中的，并且受到一系列调控因子的影响。这种平衡的打破通常意味着各种疾病的发生。LPS刺激单核细胞能够使细胞stathmin1上调而使programmedcelldeath6下调，出现凋亡障碍的情况，而这种凋亡障碍是全身炎症反应综合征(systemicinflamatoryresponsesyndrome，SIRS)和多器官功能障碍综合征的重要原因，而异丙酚能够通过下调stathminl同时上调programmedcelldeath6抑制LPS刺激引起的这种凋亡障碍，从而发挥其抗LPS损伤作用。生物信息学的分析发现这两种蛋白质存在间接相互作用也为这一点提供了有力的支持。 4，本研究运用蛋白质组学研究方法获得鉴定的四种蛋白质为进一步深入研究异丙酚对LPS刺激人单核细胞效应的影响机制提供了有效的切入点。