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研究背景Tau蛋白病是一组渐进性神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy,PSP）、皮质基底节变性（corticobasal degeneration,CBD）、Pick病、额颞叶痴呆（frontotemporal dementia,FTD）、慢性损伤性脑病等。Tau蛋白是一种可溶性的细胞内蛋白,其可与微管结合促进微管稳定性。但在病理条件下,即tau蛋白病中,tau蛋白过度磷酸化,在神经元胞体或神经突中聚集形成神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangle,NFT）。这种异常的tau病理与神经元功能障碍、突触丢失和认知下降相关。然而,tau蛋白病的发病机制目前尚不完全明确,且缺乏有效的治疗措施。目前认为细胞内的病理性tau蛋白可被分泌到细胞外,并作为“种子”作用于相邻细胞,引发相邻细胞的tau的过磷酸化和聚集,从而实现tau病理的传播。清除细胞外的病理性tau蛋白,切断该传播途径,或可成为治疗tau病的有效手段。近期有研究报道脑源性病理性tau蛋白可以从脑内转移到外周血液循环。然而,tau蛋白转移到血液后的命运尚不清楚。研究目的本研究旨在探讨脑内tau蛋白的生理性外周清除机制,以及生理性外周清除机制在脑内病理性tau蛋白清除中的作用;进一步探讨增强tau蛋白的外周清除能力对脑内病理性tau蛋白清除的影响及其作为tau蛋白病的防治潜能。材料与方法1.脑内tau蛋白的生理性外周清除机制（1）脑脊液tau蛋白的清除速度:通过野生型（wild-type,WT）小鼠的小脑延髓池注射放射性同位素131I标记的重组人tau蛋白(131I-tau),并在注射后不同时间点检测小鼠脑组织及外周血的131I放射性并观察其动态变化,计算脑内tau蛋白代谢的半衰期。（2）Tau蛋白的外周途径清除:通过WT小鼠尾静脉注射131I-tau,在注射后不同时间点检测小鼠血液及脑组织的131I放射性并观察其动态变化,计算血液tau蛋白清除的半衰期。（3）Tau蛋白外周清除的组织定位:WT小鼠经小脑延髓池或尾静脉注射131I-tau后,检测所有外周各脏器组织的131I放射性并观察其动态变化。（4）人体tau蛋白的外周清除能力:纳入因患有房室折返性心动过速（Atrioventricular Reentrant tachycardia,AVRT）而接受射频导管消融术的患者。同时从股动脉和下腔静脉（肝静脉开口近端）采集血液并分离血浆,检测股动脉和下腔静脉内血浆总tau（total tau,t-tau）浓度,并对比血液在流经外周脏器组织代谢前后的tau蛋白的水平。2.生理性tau蛋白外周清除在清除脑内病理性tau蛋白中的作用（1）并联共生模型增加脑内tau蛋白的清除速度:在两只年龄和性别匹配的WT小鼠间建立WT-WT并联共生模型。然后向其中一只并联小鼠（注射侧小鼠）的小脑延髓池注射131I-tau,然后检测不同时间点131I放射性在注射侧小鼠和注射对侧小鼠的脑组织和外周各组织脏器的动态分布。同时对比注射侧并联小鼠和未并联的单只WT小鼠在小脑延髓池注射131I-tau后脑组织和外周脏器的131I放射性的变化速率。（2）并联共生对脑内病理性tau蛋白的清除作用:建立携带P301L突变的人tau转基因小鼠（pR5小鼠）和性别匹配的同窝WT小鼠的长期并联共生模型,并联3个月后,利用免疫组织化学染色、免疫印迹及ELISA方法检测并对比并联组pR5小鼠和对照组pR5小鼠脑内不同脑区、不同磷酸化位点和不同可溶状态的磷酸化tau的水平。计算外周系统对清除脑内病理性tau蛋白的贡献。（3）并联共生对脑内tau蛋白相关病理的影响:利用上述pR5-WT并联共生模型,通过ELISA方法检测各组小鼠脑组织及血液炎症因子的水平,探讨并联共生对脑内病理性tau介导的神经炎症的影响;通过免疫荧光双染、免疫以及等方法检测了并联组pR5小鼠、对照组pR5和WT小鼠脑内神经元丢失和凋亡、神经再生、及突触损伤的情况,探讨并联共生对脑内病理性tau介导的神经变性的影响;利用电生理膜片钳技术检测小鼠脑片海马CA1区长时程增强效应（Long-term potentiation,LTP）,探讨并联共生对突触可塑性的影响。3.增强tau蛋白外周清除降低脑内病理性tau蛋白水平（1）腹膜透析对血液tau蛋白的清除作用:纳入因患有慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）而首次接受腹膜透析的患者,采集透析前及透析4小时后的静脉血并分离血浆,ELISA方法检测并对比透析前后血浆病理性tau蛋白（pT181-Tau）的水平,以探讨腹膜透析清除血液病理性tau蛋白的能力。（2）腹膜透析促进脑内病理性tau蛋白的清除:采用3月龄的雄性pR5小鼠,给其进行短期的腹膜透析实验及微透析操作,同时收集实验过程中多个时间点的血液和微透析液样本,并用ELISA方法检测血液和脑组织间液（interstitial fluid,ISF）中病理性tau蛋白的水平的动态变化及相互关系,以探讨腹膜透析对脑内病理性tau蛋白清除的影响。微透析液中tau蛋白的浓度代表ISF中tau的含量。研究结果1.脑内tau蛋白的生理性外周清除机制（1）脑脊液tau蛋白的清除速度:经小脑延髓池注射131I-tau后,脑组织的131I放射性在注射后1小时内迅速下降,之后随时间延长放射性逐渐减弱,说明注射的tau蛋白被清除,其代谢半衰期约为3小时。在131I-tau注射后的15min,血液内已可检测到较强的131I放射性,并随时间延长放射性减弱,说明脑内tau蛋白可转移至外周循环,外周系统参与了脑内tau蛋白的清除,提示外周系统具有生理性清除tau蛋白的功能。（2）Tau蛋白的外周途径清除:经尾静脉注射131I-tau后,血液的131I放射性随时间延长而降低,说明tau蛋白在外周被清除,其代谢半衰期为3.4小时。但脑组织的放射性始终很弱,提示tau蛋白极少从外周血液转移至脑内,血液内tau蛋白主要在外周被清除,进一步说明外周系统具有清除tau蛋白的功能。（3）Tau蛋白外周清除的组织定位:131I-tau经小脑延髓池和尾静脉注射结果一致显示,在外周系统,血液、肾脏的131I放射性最高,其次是肝脏,其他脏器组织放射性很低,且血液及肾脏的131I放射性随时间延长而减弱,说明血液、肾脏和肝脏是tau蛋白外周清除的主要部位。经小脑延髓池注射后,可在外周脏器检测到较高放射性,并随时间延长而放射性减弱,但经静脉注射后,脑组织放射性始终极低,提示外周系统参与脑内tau蛋白的清除,但外周tau蛋白则主要在外周系统清除,极少进入脑内清除。（4）人体tau蛋白的外周清除能力:对比股动脉及下腔静脉血内tau蛋白水平,我们发现,动脉血tau蛋白水平显著高于下腔静脉血,说明动脉血内tau蛋白经过体循环后,被所流经的外周脏器和组织清除,提示生理条件下,人体外周系统具有清除tau蛋白的功能。2.生理性tau蛋白外周清除在清除脑内病理性tau蛋白中的作用（1）并联共生模型增加脑内tau蛋白的清除速度:小脑延髓池注射131I-tau后15min,在并联组注射对侧小鼠血液中已可检测到较高的131I放射性,而肾脏和肝脏的放射性较低,在随后4个小时内,注射对侧小鼠的肾脏和肝脏的131I放射性随时间延长而逐渐增加,但其放射性仍较血液低。说明小鼠并联模型建立成功,共同的循环系统已形成;脑内tau蛋白可经共享的血液循环进入对侧小鼠体内,并被对侧小鼠的外周系统清除,为长期并联共生实验奠定理基础。并联组注射侧小鼠脑组织内131I放射性的下降速率较单只小鼠更快,同样的,血液和肾脏的放射性也是在并联小鼠下降更快,说明并联共生模型可通过增加一套额外的外周系统,加强tau蛋白的外周清除效率,进而促进脑内tau蛋白的清除,可作为探讨生理性外周清除在脑内病理性tau蛋白清除中的作用的研究模型。（2）并联共生对脑内病理性tau蛋白的清除作用:免疫组化染色结果显示,并联组pR5小鼠脑内皮层、海马和杏仁核区域的病理性tau蛋白均较对照组pR5小鼠降低。免疫印迹结果表明,在并联组pR5小鼠脑组织中,tau蛋白的Ser404、Thr231、Ser199、Thr181几个位点的磷酸化水平亦显著低于对照组。ELISA结果显示,并联pR5小鼠脑组织TBS提取物中（TBS可溶）和SDS提取物中（TBS不可溶）的tau蛋白Thr231和Thr181位点的磷酸化水平均较对照组降低。根据ELISA检测的Thr231检测结果,我们计算了一套外周系统可清除脑内产生tau病理总量的约19%,即脑内约19%的病理性tau蛋白通过外周途径清除。（3）并联共生对脑内tau蛋白相关病理的影响:pR5小鼠脑内促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平较WT小鼠显著增高,而并联共生可降低pR5小鼠脑内的促炎因子TNF-α、IFN-γ水平,说明并联共生可减轻pR5小鼠脑内的炎症反应。与对照组pR5相比,并联pR5小鼠脑内Map-2阳性染色面积增加,Caspase-3染色面积减少,说明并联共生减轻pR5小鼠脑内神经轴突结构的破坏,减少神经元凋亡;突触后膜结构蛋白PSD-95和PSD-93,囊泡相关蛋白synaptophysin、SNAP-25和VAMP-1,以及神经发生的标志蛋白NSE和DCX,在并联pR5组较pR5对照组增多,说明并联共生减轻pR5小鼠脑内突触结构及功能的破坏。以上结果提示并联共生可改善脑内病理性tau蛋白介导的神经变性。但是对照组pR5小鼠和并联组pR5小鼠海马区的LTP并无显著差异,提示在并联组pR5小鼠脑内突触可塑性受损情况并未得到改善。3.增强tau蛋白外周清除降低脑内病理性tau蛋白水平（1）腹膜透析对血液tau蛋白的清除作用:对比CKD患者腹膜透析前后血液病理性tau蛋白pT181-Tau水平,我们发现,腹膜透析后血液pT181-Tau水平较透析前降低,说腹膜透析可有效清除血液病理性tau蛋白,可作为增强tau蛋白外周清除的方法。（2）腹膜透析促进脑内病理性tau蛋白的清除:在pR5小鼠的腹膜透析实验中,我们发现,腹膜透析开始后的1h内,血浆t-tau水平已显著降低,在透析开始后的2-3小时内达到最低水平,说明腹膜透析可以清除血液内tau蛋白。ISF中t-tau与p-tau水平在腹膜透析后亦明显下降,其变化趋势与血浆tau基本一致,但ISF中tau蛋白水平下降较血液中tau的下降延缓约1个小时,提示腹膜透析可以通过加强外周tau的清除降低血液中的tau蛋白水平,进而降低脑内病理性tau蛋白的水平。结论在本研究中,我们首次证明机体存在tau蛋白的生理性外周清除机制,即生理条件下,tau蛋白可从脑内转移至外周系统,并被外周系统清除;并联共生研究表明脑内约19%的病理性tau蛋白经外周清除机制代谢,提示生理性外周清除在脑内病理性tau蛋白的清除中发挥重要作用;增强tau蛋白外周清除可促进脑内病理性tau蛋白的清除,是tau蛋白病的潜在防治途径。综上,本研究揭示了外周系统对脑内病理性tau蛋白的生理性清除功能,并为通过增强tau的外周清除能力治疗tau蛋白病提供了概念验证性证据。本研究为通过系统途径理解其他神经退行性疾病的发病机制及寻找治疗策略提供了借鉴。