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目的:α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAchR)在淋巴细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞、树突状细胞及内皮细胞等多种非神经元细胞均有表达,并且发挥重要功能。该受体能够控制T细胞的凋亡、B细胞的发育及抗体的分泌;调节巨噬细胞和神经胶质细胞释放致炎细胞因子;它还影响树突状细胞的吞噬功能及分泌细胞因子的能力。本实验检测小鼠调节性T细胞是否表达α7nAchR,然后刺激或阻断该受体,观察调节性T细胞免疫抑制活性的变化,进而阐明α7nAchR在调节性T细胞介导的T淋巴细胞免疫抑制功能中的地位。方法:1.采用免疫磁珠法分选正常C57BL/6J小鼠脾脏CD4+CD25+Treg,流式细胞术鉴定CD4+CD25+Treg细胞的纯度;2.采用免疫荧光染色、Western印迹和逆转录聚合酶链反应技术检测Treg表面α7nAChR蛋白/基因表达。3.不同浓度的烟碱(0.1~10μM)刺激Treg24小时,流式细胞术分析Treg细胞抑制性分子CTLA-4和Foxp3的表达变化;ELISA分析Treg分泌IL-10和TGF-β1的变化;烟碱处理后的Treg与CD4+CD25"T共培养,MTT法检测T淋巴细胞增殖程度;ELISA检测上清液中IL-2、IL-4和IFN-y浓度变化。最终确定烟碱刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的剂量-效应关系。4. Treg在0.1μM烟碱中孵育不同时间(12-36h),同样的方法检测Treg的上述功能指标。确定烟碱刺激和Treg细胞免疫抑制活性之间的时间-效应关系。5.用α-银环蛇毒素预孵育Treg细胞,封闭α7nAChR,再用烟碱刺激Treg细胞,观察α-银环蛇毒素能否取消烟碱诱导的效应。结果:1.免疫磁珠法分选得到的CD4+CD25+T细胞纯度在90%以上,台盼蓝染色显示细胞活性大于97%。2.α-银环蛇毒素-FITC染色,流式细胞仪和共聚焦显微镜成像分析显示Treg细胞表面结合α-银环蛇毒素-FITC; Western印迹检测证实Treg细胞样本中检测到了清楚的α7nAchR条带,分子量大小约为55 kD; RT-PCR分析发现Treg细胞样本中检测到了199bp大小的特异性α7nAchR目的基因条带。3.0.1μM烟碱孵育Treg细胞24h,其抑制活性显著增强(P<0.01)。进一步研究显示,与未刺激组相比,0.1μM烟碱孵育Treg24h,CTLA-4表达上调(P<0.01);0.1μM或1μM烟碱孵育Treg24h, Foxp3表达上调(P<0.01);0.1~10μM烟碱孵育Treg24h,Treg细胞分泌IL-10和TGF-β1的能力没有变化;0.1μM烟碱孵育Treg24h, Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2的浓度下降(P<0.05)。另外,0.1~10μM烟碱孵育Treg24h, Treg/CD4+CD25T共培养细胞上清液中IL-4/IFN-γ浓度比值没有改变。4.与正常Treg细胞比较,Treg在0.1μM烟碱中孵育12h或24h,其抑制CD4+CD25-T细胞增殖的能力显著增强(P<0.01,P<0.05)。进一步研究发现,与正常Treg细胞比较,烟碱孵育12h组Treg细胞CTLA-4和Foxp3表达上调(P<0.01),24h组差异也有统计学意义(P<0.05);各组上清液中IL-10和TGF-β1浓度没有变化;0.1μM烟碱孵育Treg12小时,Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2浓度比正常Treg组低(P<0.05)。但是,该组细胞上清液中IL-4/IFN-γ浓度比值与正常Treg组没有差异。5.烟碱刺激组Treg介导的T淋巴细胞免疫抑制活性上调,α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组中烟碱诱导的上述效应消失(P<0.01);烟碱上调CTLA-4和Foxp3的表达,α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组中烟碱的上述效应消失(P<0.01);烟碱刺激组Treg/CD4+CD25(?)T共培养细胞上清液中IL-2浓度较正常对照组下降,α-银环蛇毒素+烟碱联合刺激组IL-2浓度恢复至正常对照组水平。另外与正常对照组相比,α-银环蛇毒素刺激组中Treg/CD4+CD25-T共培养上清液IL-4/IFN-γ浓度比值下降(P<0.01)。结论:1.小鼠CD4+CD25+Treg细胞表达α7nAChR。2.适当浓度的烟碱可以上调CTLA-4和Foxp3的表达,降低Treg/CD4+CD25-T共培养细胞上清液中IL-2浓度,最终增强Treg介导的T淋巴细胞免疫抑制活性。3. a7nAChR特异性拮抗剂可以逆转碱的上述效应,表明烟碱借α7nAChR产生上述效应,α7nAChR是介导Treg免疫抑制效应的受体之一。4.封闭α7nAChR可以促使Treg极化Th1细胞。