黄瓜花粉和胚囊发育过程观察及未授粉子房培养

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为了寻求黄瓜(Cucumis sativus L.)未授粉子房诱导胚状体的最佳培养条件,本文以自交系“IL69”为材料,主要研究了胚囊发育时期、激素种类和浓度、诱导培养基等影响未授粉子房培养的因素,同时观察了黄瓜花粉和胚囊的发育过程,以期为将来黄瓜单倍体培养奠定重要的实践和理论基础。结果表明: 1.花粉发育过程当雄花花冠长度在0.85~1.40 mm时,花粉母细胞大部分处于二分体时期;多数花粉处于单核居中期时,花冠长度在2.20~3.10 mm当花冠长度在3.70~4.50 mm时,超过50%的花粉发育至单核靠边期;当花冠长度达到5.6 mm时,大部分花粉己发育为成熟花粉粒。在四分体早期,常常有多于4个花粉细胞聚集在一起而成为多分体的现象;在四分体晚期,可以看到4个细胞呈“十”字交叉形分布。 2.胚囊发育过程子房长度在4 mm以下时,胚珠原基微微隆起,随着子房长度的增加,胚珠原基的弧度不断增大。在子房长至14~16 mm时,可以见到孢原细胞和3条背缝线:当子房长度在17~21 mm时,原来的3条背缝线变成了4条,同时也出现了周缘细胞和造孢细胞;在子房达到22 mm后,背缝线又变成了3条,直至子房开花,此时已可以见到胚囊母细胞和其二分体:胚囊母细胞发育至四分体时,子房长度已在24~25 mm。此后在开花前3 d时,胚囊处于单核期;在开花期2 d,处于双核胚囊期;距开花还有1 d时,胚囊处于四核期:距开花还有12 h时,胚囊发育至八核期;胚囊最终在开花当天发育成熟,但合点端的3个反足细胞已经退化。 3.未授粉子房培养胚囊发育时期对未授粉子房胚状体的诱导效果有极大的影响,其中开花当天的成熟胚囊效果最好,与其余4个胚囊时期间的差异均达到了极显著水平。其平均出胚段率和个数都达到了最高,分别为50.1%和3.21个/段。TDZ浓度的改变对胚状体诱导的影响不太大,但以0.09 mg·L-1,诱导效果最好,达到了40%和1.92个/段的平均出胚段率和个数。3种诱导培养基①CBM+0.05 mg·L-1 NAA+0.2mg·L-1BA,②CBM+0.05 mg·L-1 NAA+0.2mg·L-1 BA+2.0 mg·L-1 AgNO3,③MS+0.1 mg·L-1N NAA+0.5 mg·L-1 BA+2.0 mg·L-1 AgNO3对胚状体的诱导效果有极显著差异,其中③的效果最好,达到了48.9%和2.13个/段的平均出胚段率和个数,②中则是32%和2.0个/段,而诱导培养基①的诱导效果最低;3种诱导培养基诱导出的胚状体,胚性愈伤和愈伤组织的比例有很大差异,其中②诱导的胚状体最多,达到了66.7%,③诱导的愈伤组织最多,达到了78.7%。而白化现象则在①中最为严重,达到了78.2%,由此认定诱导培养基②最适宜黄瓜未授粉子房胚状体诱导。 胚囊发育时期、TDZ浓度和诱导培养基之间均存在交互作用,其中胚囊发育时期和诱导培养基间的交互作用最明显,对平均出胚段率和个数的影响都达到了极显著。就不同的处理组合而言,平均出胚段率最多的是诱导培养基③中开花前12 h和0.05 mg·L-1 TDZ组合,达到了87.5%,而最低的是诱导培养基①中的开花前12 h和0.05 mg·L-1 TDZ组合,只有5.56%的出胚段率。7.29个/段的平均出胚个数是所有处理组合中最高的,它所在的组合是诱导培养基②中的开花当天未授粉子房和0.03mg·L-1TDZ,出胚个数最少的是诱导培养基②中只有0.1个/段的开花前2 d未授粉子房和0.05 mg·L-1TDZ组合。 2,4-D诱导下的平均出胚段率为16.2%,出胚个数为1.03个/段,最高出胚段率为36.5%,最高出胚个数是2.69个/段,它们所处的组合均为开花前1 d,1.0 mg·L-1的2,4.D。2,4-D诱导时,产生的胚状体占18.9%,胚性愈伤占22.3%,愈伤组织占58.9%;胚囊发育时期间存在极显著差异,但0.2 mg·L-1和1.0 mg·L-1的2,4-D浓度之间以及它们和胚囊发育时期间的交互作用都不显著。整体而言,2,4-D-对黄瓜未授粉子房胚状体的诱导效果不如TDZ。4.胚状体形成过程诱导培养10 d后,出现大量球形胚,14 d后,形成梨形胚,18 d后,可以看到心形胚,鱼雷形胚要在诱导培养25 d后才能见到,子叶形胚前期须经诱导培养29 d才能看到,而子叶形胚后期是在诱导培养后36 d才看到的。诱导培养42 d后,极少数的子叶形胚萌动变绿。诱导中,无论形成的是胚状体、胚性愈伤还是愈伤组织,它们的发生部位均在胚珠内--产生单倍体的唯一部位。
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