研究背景纤维化是一种组织病理学概念,是组织器官在损伤因素作用下过度修复的病理结果,是慢性病变引起器官功能衰竭的主要原因,主要涉及心、肺、肝、肾、皮肤等组织器官,但目前尚无有效的逆转和阻断组织器官纤维化的药物。肝纤维化和肾间质纤维化是其中研究的热点之一肝纤维化(liver fibrosis LF)是肝炎病毒、酒精、药物、代谢及免疫功能失衡等因素损伤肝细胞,释放炎症因子,诱导单核-巨嗜细胞、Kupffer细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润,激活肝星状细胞(hepatic stellate cell HSC)并发生纤维样表型转化,引起细胞外基质(extracellular matrix ECM)代谢失衡,大量沉积在肝组织内的病理结果。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis RIF)是细菌、病毒、射线、药物、毒物等损伤肾脏固有细胞,激活肾间质成纤维细胞,诱导肾小管上皮细胞(tubular epithelial cell TEC)纤维样表型转化,促进细胞外基质在间质内大量合成,引起肾功能进行性恶化的病理变化。肝、肾纤维化形成的病理过程,调控机制,病变实质等近乎一致的结果及用同一基因或细胞因子的拮抗剂缓解纤维化病变的治疗效果,与中医辩证论治中“异病同治”的思维逻辑相符合。中医“异病同治”理论的精髓是“证同治亦同”,“证”是治疗的基础和指导。证候是对疾病发展过程中某一阶段的病理概括；是在整体观念指导下,运用中医理论对疾病的表现在外的症状、体征的提炼；疾病的症状、体征是基因的表达、调控产物,故,证候也是对“基因表达产物”的高度概括。因此,我们可以借助现代医学中的基因芯片技术和生物信息技术探究肝、肾等器官纤维化形成的共同的分子机制,发挥中医药特有的“靶点集合”优势,是逆转纤维化,挽救器官衰竭的关键。传统的中医学中无肝纤维化和肾纤维化的病名记载,临床上根据两者的症状、体征等外在表象,把肝纤维化归结为“瘾积”、“积聚”、“鼓胀”、“肝着”等疾病范畴,肾纤维化归结为“水肿”、“癃闭”、“关格”等疾病范畴；近现代的中医络病理论则把肝、肾纤维化归属于“阴络病——络在脏腑的病变”的范畴,大多数络病研究者认为“络脉瘀阻”是肝、肾纤维化形成的共同机制。临床上缓解肝、肾纤维化的药物大多具有“活血”的功效。红背叶根为双子叶植物药大戟科植物红背山麻杆的根,隶属于络病用药中的“藤类”。其“味甘,性凉”,具有“解毒、除湿、止血”之功效。前期研究已表明红背叶根通过抑制肿瘤坏死因子-α,白介素-1,转化生长因子-β,金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达,保护卡介苗和脂多糖诱发的肝损伤,缓解酒精性大鼠肝纤维化和四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的作用。红背叶根是否具有“活血通络”之功效?是否可以改善大鼠肾间质纤维化?是否可以作为中医药“靶点集合”中抗纤维化的药物之一?是开发研究红背叶根的关键内容。研究目的观察肝、肾纤维化共同表达基因谱的变化规律,探究纤维化发生的分子机制；观察红背叶根对免疫性大鼠肝纤维化和单侧输尿管梗阻致大鼠肾间质纤维化病理、血液流变学和微循环的变化的影响,从络病角度探讨其抗纤维化的病机关键。研究方法一、构建猪血清致大鼠肝纤维化模型SPF级SD大鼠24只,雌雄各半,体质量100-120g,适应性的饲养一周后,随机均分为3组：正常对照组、肝纤维化模型组、红背叶根组。肝纤维化模型组(以下简称：模型组)和红背叶根组分别于10am腹腔内注射猪血清,每次0.5ml/只,每周2次,正常对照组腹腔注射等量的生理盐水；红背叶根组于3pm给予红背叶根煎剂1/100体质量灌胃,模型组和正常组予相应剂量生理盐水灌胃,每日1次。所有动物均予普通饲料,自由饮水,共12周。二、构建单侧输尿管梗阻致大鼠肾间质纤维化模型SPF级SD大鼠24只,雌雄各半,体质量180-200g,适应性的饲养一周后,随机均分为3组：假手术组、肾间质纤维化模型组、红背叶根组。肾纤维化模型组(以下简称：模型组)和红背叶根组于9am以水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉,取左侧腹肾区切口,用眼科镊分离左侧输尿管,用五号手术线在肾盏处和肾下极处分别结扎输尿管,但并不离断输尿管,并保护好肾包膜及周围组织,术后把肾置于原位,逐层缝合肌肉、皮肤；假手术组：除不结扎输尿管外,其余步骤与模型组相同；术中严格遵守无菌操作。红背叶根组于3pm给予红背叶根煎剂1/100体质量灌胃,模型组和假手术组予相应剂量生理盐水灌胃,每日1次。所有动物均予普通饲料,自由饮水,共5周。三、体视显微镜观察大鼠舌下、耳廓的脉络造模期满前一天8pm,动物禁食,于次日8am用10%水合氯醛腹腔麻醉,取仰卧位,用镊子轻轻夹住大鼠舌尖从左轻轻拉出,直至露出舌根部,使整个舌体与大鼠躯干成直线或有小于15。的夹角,用80倍的体视显微镜观察舌下脉络；后取侧卧位,将左侧耳廓置于“耳托”上,呈平面展开,再用80倍的体视显微镜观察耳廓背侧脉络；所有采集图像导入联想电脑,采用ACDsee v3.2和windows图片和传真查看器看图软件查看。四、检测纤维化和血流变学指标图像采集完毕后,剖开腹腔,取部分肝纤维化大鼠的肝组织和肾间质纤维化大鼠的肾组织,HE染色,光镜下观察肝、肾组织的纤维增生程度,并参照文献[15-16]制定胶原纤维增生程度半定量标准。取1ml的全血用普通压积管离心后测定红细胞压积；取动物血清上层,用GTM-STEELLEX R-80A血液流变仪测定不同切变率的全血粘度,用ECHO LCD全自动生化分析仪测定血清血清谷丙转氨酶(glutamate-pyruvate transaminase ALT)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic tra nsaminase AST),用SN-682型放射免疫r计数器测定血清透明质酸(hyaluroni c acid HA)、层粘连蛋白(laminin LN)、Ⅲ型前胶原(precollagen typeⅢPCⅢ)、Ⅳ型胶原(collagen typeⅣCIV)。五、用基因芯片技术和生物信息技术分析肝肾纤维化的共同表达基因谱用北京博奥生物公司的大鼠全基因组的寡核苷酸芯片检测肝、肾纤维化大鼠的差异表达基因,并筛选出共同表达基因；用Gene Ontology、MILANC、Pan ther、Genomatix软件对肝肾纤维化共同表达基因进行生物信息学分析,绘制信号通路图。研究结果一、肝、肾纤维化大鼠模型的组织病理学改变肝纤维化模型组大鼠的肝组织内可见明显的纤维增生,伴炎性细胞浸润,并形成细长的纤维间隔向小叶内延伸；并与正常组相比,模型组大鼠肝组织内胶原纤维的增生程度显著增加(P<0.01)。肾间质纤维化模型组大鼠的肾间质内纤维明显增生,伴炎性细胞的浸润,肾小管萎缩,消失；并与假手术组相比,模型组大鼠肾间质内胶原纤维的增生程度显著增加(P<0.01)。二、肝、肾纤维化共同表达基因的生物信息学分析经博奥生物公司大鼠寡核苷酸芯片检测,肝纤维化大鼠的差异表达基因共1205个,肾间质纤维化大鼠的差异表达基因共2550个,经分析、筛选,两者的共同表达基因有311个,其中上调的基因共134个,下调的基因共177个。对肝肾纤维化共同表达基因进行生物信息学分析,发现这些基因主要参与了与凋亡(p53信号通路,PI3激酶信号通路,G蛋白偶联信号通路等),细胞外基质代谢(整联蛋白信号通路,Rho GTP酶调节细胞骨架,钙调蛋白信号通路,EGF信号通路,FGF信号通路TGF信号通路Toll受体信号通路Notch的信号通路等),炎症(氧化应激,白介素信号通路,细胞因子调节的炎症信号通路等)等有关的信号转导通路；形成了以caspase3为核心的基因功能联系网络和以转录因子Nfkb1、Tp53为轴心两个基因密集点。三、红背叶根对免疫性肝纤维化大鼠血流变及微循环变化的作用红背叶根能显著降低肝纤维化大鼠的全血粘度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率、红细胞压积、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)指数,改善纤维化大鼠舌下和耳廓脉络的循环状态。四、红背叶根对肾间质纤维化大鼠血流变及微循环变化的作用红背叶根能显著降低肾间质纤维化大鼠的全血粘度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率、红细胞压积、透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、血清肌酐(serum creatinine SCr)、尿素氮(blood urea nitrogen BUN)指数,改善纤维化大鼠舌下、耳廓脉络的循环状态。研究结论1、细胞凋亡是纤维化形成的主要启动因素,P53介导的信号转导通路可能是凋亡致纤维化形成的主要分子机制。2、肝、肾大鼠纤维化的高表达的Lyve1基因,位于细胞凋亡和细胞外基质代谢失调通路中,可能是纤维化形成的关键基因之一。3、红背叶根具有活血通络之功效。4、红背叶根对猪血清致大鼠肝纤维化和单侧输尿管梗阻的大鼠肾间质纤维化的拮抗作用,有望成为中医药“靶点集合”逆转纤维化的主要成员之一